Su richiesta della Balía, che chiamava lo Studio “occhio principalissimo della reputazione” di Siena, il successore di Francesco I, Ferdinando, introdusse alcune importanti riforme nel corpo docente, che fu distribuito nei collegi dei medici, dei giuristi e degli “artisti”, comprendenti filosofi e teologi prima organizzati autonomamente. Furono poi introdotti i concorsi a cattedre, al fine di evitare nomine “politiche” dei docenti e nel 1591 furono attribuiti nuovi poteri giurisdizionali al Rettore dello Studio, eletto non solo dai rappresentanti degli scolari, ma anche dai più alti magistrati cittadini. Il Rettore doveva essere, di preferenza, uno studente forestiero e la sua elezione veniva festeggiata con balli, mascherate e recite di commedie per quasi un mese. Durante il rettorato del tedesco Giorgio Fuccaro (1593), appoggiato dal primo Lettore di Lingua toscana Diomede Borghesi, furono approvate nuove norme per disciplinare le attività didattiche e fu richiesta l'abolizione dei protezionismi scolastici a favore dell'Ateneo pisano.
Il rapido declino delle funzioni rettorali agli albori del XVII secolo avviò un processo di municipalizzazione dello Studio, dove l'istituto dei concorsi a cattedra fu abolito nel giugno 1621 e dove mutarono gli organi direttivi, ormai monopolio esclusivo dell'aristocrazia senese fedele al granduca. Insieme ai molti lettori appartenenti a questo nucleo oligarchico locale, insegnarono a Siena fra il Sei e il Settecento anche alcuni maestri di fama internazionale, come – ad esempio – Pirro Maria Gabrielli, fondatore nel 1691 dell'Accademia dei Fisiocritici, sorta a Siena a somiglianza della fiorentina Accademia del Cimento.
Superata la difficile situazione economica in cui si era venuto a trovare al momento dell'estinzione della dinastia medicea nel 1737, l'Ateneo senese acquisì sotto il governo dei Lorena la grande biblioteca di

Sallustio Bandini, l'illustre economista precursore dei Fisiocrati, e rinnovò la sua amministrazione, guidata da un Provveditore nominato dal granduca. Con l'occupazione francese della Toscana nel 1808, lo Studio di Siena fu soppresso e il suo Provveditore fu nominato commissario della nuova Scuola medica, unico surrogato napoleonico dell'antica Facoltà di medicina. Ripresa poi l'attività sotto il restaurato Ferdinando III, lo Studio, suddiviso in quattro Collegi (legale, medico-fisico e teologico, cui si aggiunse in seguito quello filosofico), fu trasferito dalla Casa della Sapienza nei locali dell'ex-convento dei Vallombrosani, vicino alla chiesa di san Vigilio.
Fin dal 1832, in occasione dei primi moti risorgimentali, molti studenti senesi, incuranti della repressione granducale, si iscrissero alla Giovine Italia e parteciparono con entusiasmo a varie manifestazioni patriottiche. Nel luglio del 1847 uno di essi, Ludovico Petronici, appartenente al Collegio medico e noto come liberale, fu ucciso in uno scontro con la polizia. Dopo questo tragico episodio i rapporti fra autorità e scolaresca divennero sempre più tesi, finché nell'aprile 1848 tre professori, un assistente e cinquantacinque studenti dell'Ateneo senese costituirono la compagnia della Guardia universitaria e parteciparono, a fianco dei colleghi pisani, alla decisiva difesa dell'esercito sardo nei campi lombardi di Curtatone e Montanara. Col decreto del 28 ottobre 1851 Leopoldo II stabilì che a Siena rimanessero solo le Facoltà di giurisprudenza e teologia, mentre a Pisa dovevano essere concentrate medicina, filologia e filosofia, scienze matematiche e scienze naturali. Otto anni dopo, il governo provvisorio insediato al posto del granduca, che era stato costretto ad abbandonare Firenze, riorganizzò le due Università, privilegiando però quella pisana, soprattutto riguardo alle Facoltà umanistiche.