CERBONI Barbara

STUDIO DI ENZIMI DEL CATABOLISMO DI NAD E LORO IMPLICAZIONE IN PARTICOLARI FENOMENI CELLULARI (PATOLOGIE E MORTE CELLULARE PROGRAMMATA)

 

Il progetto di ricerca che presento riguarda lo studio del catabolismo di nucleotidi piridinici in sistemi di controllo, in patologie umane e in stati cellulari indotti (apoptosi). L’NAD, più importante nucleotide piridinico, è il principale coenzima delle reazioni di ossidoriduzione; ultimamente gli sono stati riconosciuti ulteriori importanti ruoli nell’economia della cellula. L’NAD è infatti substrato di enzimi coinvolti nei processi di riparazione e di replicazione del DNA (poli-ADPRpolimerasi: PARP-1), nella ADPribosilazione delle proteine (ADPR transferasi), nell’ingresso di NAD nella cellula e nella regolazione del rilascio del calcio intracellulare (CD-38, ADPRciclasi). In particolare è stato dimostrato che il turn-over del NAD dipende strettamente dall’attività della PARP-1 e quindi questo enzima risulta un importante regolatore della concentrazione di NAD intracellulare.
Variazione dei livelli di NAD sono state descritte in un certo numero di patologie caratterizzate da deficienze di tipo purinico, da difetti della riparazione dei danni del DNA, nella leucemia, nel cancro delle ovaie, ecc…Il NAD inoltre, come substrato della PARP-1, è coinvolto nei processi di morte cellulare programmata.Il mio progetto si inserisce in questi studi allo scopo di verificare se e quando la variazione di contenuto in NAD dipenda dalle attività cataboliche che lo riguardano o dalle attività di sintesi già studiate dal nostro gruppo. In pratica mi occuperò dello studio delle attività enzimatiche che portano alla rottura del NAD a livello del legame N-glicosidico in modo aspecifico o in modo specifico, prendendo in esame, fra le varie possibilità, la PARP-1. Mi riferirò quindi ad una generica rottura del NAD, calcolando la sua scomparsa in varie condizioni, come attività NADglicoidrolasica (NADasi), e alla utilizzazione del NAD per la produzione di poliADPR, come attività PARP.
Obiettivi di massima del progetto di ricerca saranno:
studio dell’attività degli enzimi di degradazione del NAD (NADasi, PARP-1) in condizioni fisiologiche e patologiche sia in eritrociti che in cellule nucleate umane
studio della correlazione PARP-1/apoptosi

Primo anno

Durante il primo anno si svilupperà un approccio critico alla bibliografia riguardante il progetto di ricerca. Saranno perfezionate le competenze tecniche necessarie per lo sviluppo della tesi. In particolare, saranno allestite colture di linfociti e di fibroblasti, verrà incrementata l’esperienza già acquisita nell’utilizzo di vari tipi di cromatografia, come quella su strato sottile (TLC) o ad alta pressione (HPLC), indispensabili per la determinazione dei livelli di nucleotidi e delle attività enzimatiche.Verranno ultimati i metodi di dosaggio degli enzimi che portano alla sintesi di NAD in cellule nucleate e saranno effettuati studi preliminari per la messa a punto delle metodiche per la rivelazione delle attività enzimatiche che portano alla degradazione di NAD. I sistemi sperimentali saranno lisati cellulari di eritrociti e cellule nucleate come fibroblasti e linfociti. nei quali verranno dosate l’attività enzimatica specifica e i livelli dei nucleotidi. Verranno scelti e applicati i test per l’elaborazione statistica dei risultati ottenuti.

COLINON Céline

“Dottorato di Ricerca in Scienze Biochimiche e Microbiologiche”
Field : “Microbial Drug Resistance”

CHARACTERISATION OF MOBILE METALLO-BETA-LACTAMASES DETERMINANTS FROM CLINICAL PATHOGENS : GENETICS, TRANSFERABILITY, AND PHYSIOLOGICAL ASPECTS.

- phD supervised by Prof. Gian Maria Rossolini (Dept Biologia Moleculare-Polyclinico “Le Scotte”-Siena)

INTRODUCTION

Metallo-beta-lactamases (MBL) are beta-lactamases that hydrolyse the C-N bond of beta-lactams rings with help of Zn(II) cofactor(s). MBL are of great concern in the field of bacterial drug resistance and could be considered as one of the major threats of the 21st century :
- because of their great efficacy to hydrolyse carbapenems, often used as last resort antibiotics for treatment of multidrug resistant strains, and to hydrolyse mechanism-based inactivator (tazobactam, sulbactam)
- because of the recent emergence of MBL-encoding genes integron-borne and/or plasmid-mediated (blaIMP, blaVIM), capable of horizontally spreading among nosocomial strains of Enterobacteriaceae, Pseudomonads or Gram-negative non fermenters
So far, nearly 13 variants of blaIMP and 6 of blaVIM have been characterised, but other MBL mobile determinants or/and variants could exist. Moreover, the transferability/propagation of IMP and VIM determinants and their interaction with other resistance mechanisms aren’t well studied.
To improve our knowledge in the field of bacterial drug resistance and the control of its dissemination, the objectives of this phD project will be the investigation of the genetic background of mobile MBL, the understanding of the mechanisms underlying their mobility and the investigation of MBL interaction with other resistance mechanisms (outer membrane permeability, other beta-lactamases).

I-PROJECT OF THE FIRST YEAR OF PHD : GENETICS ASPECTS

Molecular epidemiology of mobile MBL should help to understand their clinical relevance. We hope to discover new variants of mobile MBL or already existing variants never described in other species, and to investigate their clonal relationships to understand their spread or their origin (some species could be a reservoir).
Suspicious clinical isolates could be investigated for presence of mobile MBL with help of current screening technics. blaIMP- and blaVIM-related variants as well as new MBL variants could be detected and characterised at the molecular and/or biochemical level in order to assign it in the beta-lactamase classification. Expression in vivo into E.coli and P.aeruginosa could also be investigated (models need to be developped).

II-FOLLOWING YEARS : TRANSFERABILITY AND PHYSIOLOGICAL ASPECTS

Mechanisms of transferability, interplay with other resistance factors.

PS : please consider that part II of the PhD program could be done at any time and that part I could be prolongated until end of the PhD depending on the established collaborations and on the supply of MBL positive strains.

DI MARCELLO Federica

CARATTERIZZAZIONE DI NUOVI ANTIGENI DI NEISSERIA MENINGITIDIS UTILIZZANDO COME MODELLO E.COLI

Neisseria meningitidis, diplococco gram-negativo aerobio, è un patogeno esclusivamente umano il cui habitat naturale è rappresentato dalla membrana mucosale del nasofaringe. In particolari condizioni meningococco è in grado di superare la barriera epiteliale e raggiungere il sangue, causando setticemia, o superare la barriera emato-encefalica e provocare meningite. Attualmente la somministrazione di antibiotici quali penicillina e rifampicina costituisce il trattamento di elezione per la cura della meningite, ma il mezzo più promettente nella prevenzione della morbidità e mortalità associate alle infezioni meningococciche è rappresentato dai vaccini. Il progetto MenB, nato con l’obiettivo di identificare degli antigeni nuovi come componenti di un vaccino contro meningocco B, efficace contro i diversi ceppi, si è basato sull’analisi del genoma di meningococco ed ha utilizzato l’analisi in silico della sequenza genomica per identificare i potenziali antigeni candidati per un vaccino.
Il mio programma di dottorato consiste nello studio di antigeni interessanti (perché capaci di indurre anticorpi battericidi, adesine, tossine…) identificati dall’analisi computazionale, partendo dal clonaggio dei geni in E. coli, quale sistema ospite, valutando l’espressione delle proteine sia in forma nativa che come fusioni che come forme mutanti e procedendo alla loro caratterizzazione funzionale.
Attualmente mi sto dedicando alla caratterizzazione di due degli antigeni identificati dall’analisi in silico del genoma di meningococco: NadA, una nuova adesina di N. meningitidis, e NMB1343, una proteina con attività ADP-ribosiltransferasica.
NadA (Neisseria adhesin A), antigene in grado di evocare anticorpi battericidi e presente nella quasi totalità degli isolati di ceppi ipervirulenti, possiede elementi strutturali altamente simili a YadA, adesina implicata nella virulenza di Yersinia enteropatogenica, e UspA2, proteina di superficie di Moraxella catarrhalis coinvolta nella resistenza al siero. Analogamente a YadA ed UspA2, anche NadA forma oligomeri ad alto peso molecolare ancorati alla membrana esterna di meningococco, stabili alla denaturazione al calore in presenza di SDS e in condizioni riducenti. Inoltre NadA risulta in grado di legare in vitro le cellule epiteliali. In E. coli, quando il gene è clonato come “full-lenght”, la proteina espressa mostra lo stesso comportamento osservato in meningococco, in quanto forma oligomeri sulla superficie del batterio e conferisce ai batteri ricombinanti la capacità di aderire alle cellule epiteliali. La proteina espressa come delezione del dominio di ancora di membrana (NadA-c) risulta solubile e, inaspettatamente, viene rilasciata nel supernatante di coltura.
Il secondo antigene NMB1343, il cui gene è posto all’interno del complesso multienzimatico della piruvato-deidrogenasi, tra i geni che codificano per le subunità E2 ed E3, è stato identificato dall’analisi computazionale del genoma di MC58 usando motivi aminoacidici specifici per tossine ad attività ADP-ribosilasica e su questa base si è rivelato omologo alla tossina termo-labile di E. coli (LT) ed alla tossina colerica (CT). La proteina presenta, inoltre, delle omologie con regioni che sono state dimostrate importanti per l’attività enzimatica in altre tossine con attività ADP-ribosiltrasferasica. In particolare due acidi glutammici e un’ arginina, tipici di transferasi arginina-specifiche e di enzimi ad attività NAD-glicoidrolasica sono oggetto del nostro studio. Saggi in vitro hanno confermato per la proteina ricombinante rNMB1343 sia attività ADP-ribosiltransferasica che NAD-glicoidrolasica, così come attività di auto ADP-ribosilazione ed hanno dimostrato che l’aminoacido accettore dell’ADP-ribosio è l’arginina. Un’analisi del locus genico suggerisce che i geni codificanti per NMB1343 ed E3 potrebbero essere co-trascritti.

Primo anno

Per quanto riguarda il primo antigene, NadA, lo scopo è quello di studiare il meccanismo di trasporto in membrana, il processo di oligomerizzazione della proteina, e di mappare il dominio di legame alle cellule epiteliali. Inoltre, un aspetto interessante è indagare il meccanismo con cui la proteina viene rilasciata nel supernatante di coltura quando è privata dell’ipotetica ancora di membrana, per capire se il processo è autonomo o mediato da un sistema di secrezione diverso, comune sia a E. coli che a meningococco. La domanda è quindi se l’informazione necessaria all’export di NadA in superficie sia contenuta nell’ancora di membrana, come nel caso delle proteine “autotransporter”, o sia invece racchiusa in un’altra regione all’interno della proteina. Si procederà perciò alla costruzione di mutanti di delezione e alla sostituzione del dominio di ancora di membrana con quello di altre proteine, già identificate come “autotransporter”. Relativamente al meccanismo di rilascio nel supernatante di coltura, uno degli approcci consisterà nella sostituzione della sequenza “leader” con quella di altre proteine, note per essere secrete, in modo da avere indicazioni sulla specificità o meno del fenomeno che interessa NadA. La progressiva delezione delle porzioni “coiled-coil” della proteina potrebbe fornire informazioni riguardo al processo di oligomerizzazione. Inoltre, il processo di oligomerizzazione potrebbe anche influenzare le proprietà di legame alle cellule, e ciò sarà valutato saggiando le proprietà adesive di questi mutanti, sia come proteine purificate sia come cloni di E. coli che esprimono le diverse forme. Questa analisi ci permetterà di verificare se è la forma monomerica o quella oligomerica a legare le cellule epiteliali. Infine, partendo dall’ipotesi che sia la regione N-terminale della proteina, generalmente riferita come “testa”, ad essere direttamente coinvolta nel processo di legame alle cellule, delezioni interne a questa regione potrebbero darci indicazioni sul dominio che media il legame ad un recettore cellulare.

Per il secondo antigene, NMB1343 è innanzitutto fondamentale cercare di definire la localizzazione cellulare della proteina in meningococco (citoplasma, periplasma, supernatante di coltura) sia in condizioni “normali” di crescita, sia dopo adesione del batterio con le cellule, come importante è stabilire la localizzazione della proteina ricombinante in E.coli, per verificare se quest’ultimo possa essere utilizzato come modello. Data l’attività ADP-ribosilasica della proteina, verificheremo, attraverso la costruzione di mutanti a livello del Arg e Glu, il ruolo svolto da questi residui nell’attività enzimatica. Inoltre, mutazioni a livello dell’arginina potrebbero fornire informazioni addizionali sul processo di auto ADP-ribosilazione. L’altra domanda a cui si vorrebbe cercare di dare una risposta è se la proteina sia in grado in qualche modo di interagire con le cellule e se sia in grado di provocare in queste alterazioni morfologiche. A tale proposito saranno saggiate più linee cellulari con lo scopo di individuare un possibile target.

GIULIANI Francesco

CLONAZIONE E CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA E STRUTTURALE DI NUOVE ESbL E/O DI ESbL DI NOTEVOLE INTERESSE CLINICO

Lo scopo di questo progetto di ricerca è la clonazione e la successiva caratterizzazione biochimica e strutturale di nuove ESbL e/o di ESbL di notevole interesse clinico.
Il progetto sarà articolato in più fasi:
· “screening” di ceppi clinici provenienti da diverse aree geografiche, allo scopo di trovare, possibilmente, nuovi determinanti di resistenza appartenenti alle ESbL.
· Produzione e purificazione di ESbL nuove ritenute di interesse clinico.
· Caratterizzazione biochimica degli enzimi purificati
· Espressione dei geni in ceppi di laboratorio di E. coli per valutare l’effetto in vivo.
Le informazioni ottenute da tale ricerca potranno essere importanti per un’ulteriore comprensione del processo di ampliamento dello spettro di resistenza, con particolare riferimento allo studio della localizzazone dei residui aminoacidici importanti a tale scopo; questi studi rappresentano inoltre un presupposto indispensabile per comprendere la natura tridimensionale del sito attivo e per sviluppare nuovi inibitori potenzialmente utili a fini terapeutici.

Primo anno

Nel corso del primo anno di dottorato, l’attività di ricerca prevederà l’overproduzione e la purificazione di una o più nuove ESbL, provenienti da ceppi di interesse clinico.
A questo scopo, sarà determinato il profilo di resistenza agli antibiotici b-lattamici dei ceppi batterici in esame per mezzo di antibiogramma e saggio del doppio disco, e, a partire dai ceppi di maggiore interesse, saranno amplificati mediante PCR i determinanti di resistenza ai b-lattamici. In seguito alla determinazione della sequenza nucleotidica e aminoacidica dei prodotti di PCR ottenuti, al fine di ricercare eventuali mutazioni che differenzino questi enzimi da quelli già caratterizzati, si procederà all’eventuale clonaggio delle varianti geniche di nuova selezione in vettori di espressione per la produzione di proteine eterologhe in ospiti batterici; in particolare, potranno essere utilizzati vettori di espressione con promotore forte che consentano un’espressione finemente regolata e di alto livello di geni eterologhi.
La purificazione degli enzimi prodotti sarà svolta mediante tecniche cromatografiche, in base alle loro caratteristiche strutturali e alla determinazione del loro punto isoelettrico mediante IsoElectric Focusing (IEF).

MAGRINI David

IDENTIFICAZIONE DI NUOVI EFFETTORI DELLE PROTEINE Rap E DETERMINAZIONE DEL LORO RUOLO FUNZIONALE

Lo studio dei meccanismi di regolazione cellulare da parte di proteine G a basso peso molecolare ed in particolare del ruolo svolto dalle proteine Rap nei processi di attivazione ed inibizione cellulare, ha portato all’isolamento ed all’identificazione, attraverso lo screening di una genoteca di cDNA di placenta umana usando il metodo del doppio ibrido, della proteina RGL2 appartenente alla famiglia delle RalGDS. Tale proteina si comporta da effettore per Rap1b ma ha le caratteristiche di fattore di scambio per proteine della famiglia Ras, per cui possiede la potenzialità di accoppiare il segnale di Rap1b con quello di altre piccole GTPasi, svolgendo un’importante ruolo nella regolazione di diverse funzioni cellulari. Sono già stati effettuati numerosi studi che hanno parzialmente caratterizzato a livello funzionale la porzione C-terminale della proteina RGL2.
Alla luce dell’importanza che le proteine G a basso peso molecolare rivestono nell’ambito dei meccanismi di regolazione di svariati processi cellulari, gli obiettivi prefissati sono quelli di comprendere più a fondo la funzione ed il ruolo biologico di RGL2 nei diversi processi cellulari e di individuare nuovi potenziali effettori.
Il programma sarà svolto sviluppando i seguenti punti:
1) caratterizzazione funzionale di RGL2, in particolare dell’estremità N-terminale;
2) determinazione della distribuzione tissutale e dei livelli di espressione di RGL2;
3) ricerca di nuovi effettori per le proteine Rap.

Primo anno

La proteina RGL2 fa parte della famiglia delle RalGDS ed ha la caratteristica di interagire con Ras, Rap ed altre proteine G della superfamiglia Ras, costituendone un potenziale effettore. La proteina é stata isolata mediante lo screening di una genoteca di cDNA di placenta umana utilizzando il metodo del doppio ibrido e possiede un’elevata omologia di sequenza con i fattori di scambio RalGDS, RGL e Rlf, con i quali condivide la presenza nella struttura di un dominio N-terminale omologo al dominio di scambio del nucleotide guanilico di CDC25 e di un dominio C-terminale, chiamato Ras Binding Domain (RBD), coinvolto direttamente nell’interazione con Ras o proteine Ras simili.
Poichè attualmente é conosciuto ed è in nostro possesso solo il cDNA della proteina ma non la proteina matura così come viene espressa nelle cellule, durante il primo anno di dottorato ci si propone di determinare quale é la distribuzione tissutale di RGL2 ed eventualmente individuare differenze nei livelli di espressione fra i vari tessuti.
A tale scopo é stato prodotto un’antisiero immunizzando dei conigli contro un frammento ricombinante di RGL2 che codifica per 233 aminoacidi C-terminali (RGL2-233). L’antisiero in questione sarà utilizzato in uno spot-test per analizzare una serie di estratti proteici di tessuti umani e di linee cellulari, sia sane che tumorali, dello stesso tipo. I campioni risultati positivi saranno sottoposti ad elettroforesi bidimensionale ed immunoblotting con l’antisiero. Successivamente, eventuali spot immunoreattivi saranno sottoposti ad analisi mediante microsequencing e/o spettrometria di massa atomica, per verificare l’identità della proteina corrispondente. Inoltre potranno essere determinati alcuni parametri reali della proteina nativa, quali punto isoelettrico e peso molecolare, finora solo ipotizzati sulla base del cDNA. Poichè é previsto l’uso di cellule tumorali, sarà interessante valutare se esistano differenze nell’espressione di RGL2 in cellule sane e nelle corrispondenti linee tumorali. Dai risultati ottenuti potranno essere ricavate preziose informazioni riguardo al ruolo funzionale di RGL2.

MILLUCCI Lia

SACCHAROMYCES CEREVISIAE COME MODELLO DI CELLULA EUCARIOTE PER LO STUDIO DEI PROCESSI DI STRESS METABOLICO INDOTTO DA AGENTI PERTURBANTI ORGANICI E/O INORGANICI

Nell’ambito del presente progetto di ricerca ci proponiamo di analizzare il proteoma di ceppi di Saccharomyces cerevisiae precedentemente selezionati. L’analisi del repertorio proteico espesso (proteoma) della cellula verrà effettuata mediante elettroforesi bidimensionale computerizzat, una tecnologia messa a punto da anni nell’unità di ricerca, che consente di separare in un unico esperimento migliaia di proteine espresse da un singolo tipo cellulare in un preciso momento della sua vita metabolica.
La medesima tecnologia consente di apprezzare anche come il proteoma possa variare in seguito a stimoli esogeni o endogeni ai quali la cellula venga sottoposta consentendo altresì di apprezzare come singole proteine possano venire modificate post-traduzionalmente a seguito degli stimoli di cui sopra.
Verrà così effettuata un’analisi comparata dei proteomi di cellule in diversi momenti della fermentazione, monitorando la concentrazione di glucosio, ovvero, il suo consumo, la produzione di etanolo (se ceppi di utilizzo enologico), la produzione di glicogeno e trealoso.
Sarà anche studiata la modificazione progressiva del proteoma in momenti chiave dela vita cellulare quali il “diauxic shift”, la fase esponenziale e la fase stazionaria di crescita. Verranno analizzati vari tipi di syress cellulare e la relativa risposta adattativa quali la carenza nutrizionale, la carenza o eccesso di ferro, l’eccesso di etanolo. Le proteine la cui presenza risulterà alterata in maniera significativa verranno identificate mediante analisi di microsequenziamento o spettrometria di massa, sfruttando la mole di informazioni sulla struttura genica derivate dal sequenziamento totale del genoma si Saccharomyces cerevisiae. Gli stessi campioni di cui sarà analizzato il proteoma saranno parallelamente studiati tramite NMR in vivo allo scopo di integrare i dati di proteomica con informazioni sulle vie metaboliche seguite dalla cellula per indurre l’adattamento cellulare alle varie condizioni ambientali esogene e/o endogene. L’integrazione tra questi due approcci sperimentali costituisce un elemento di novità di grande importanza poiché tale sinergia tecnologica investigativa appare assi promettente per ottenere una visione globale e quanto più omnicomprensiva della vita della cellula eucariota. Si prevede che le informazioni derivanti da questo tipo di studio possano fornire interessanti delucidazioni anhe sulla risposta allo stress della cellula umana, poiché sembra che l’adattamento allo stress di quest’ultima non sia molto dissimile da quello della cellula di lievito.

Primo anno

Nel primo anno di studio ci proponiamo di caratterizzare e comprendere le risposte adattative di un ceppo di S. cerevisiae per applicazioni in campo enologico valutandone i cambiamenti dell’espressione proteica durante la crescita in condizioni di stress derivante da carenza di glucosio per esaurimento nel mezzo di coltura,dopo averne caratterizzato la funzionalità metabolica e il proteoma.
Intendiamo inoltre osservare come il proteoma della cellula si modifichi in seguito all’esaurimento del glucosio quale unica fonte di carbonio in un mezzo di coltura, opportunamente modificato in modo da riprodurre le caratteristiche del mosto naturale.
Il glucosio nel mezzo non verrà repentinamente rimosso ma verrà osservato come la cellula si adatti nel tempo al progressivo consumo di nutriente, in maniera analoga a quanto avviene nel processo fisiogico della vinificazione.Il tutto sarà effettuato mediante elettroforesi bidimensionale.

STOCZKO Magdalena

PhD supervisor: Prof. G.M Rossolini

First year PhD project.

POST GENOMIC APPROACH TO MOLECULAR EVOLUTION OF METALLO-ß-LACTAMASES

Introduction:

Bacterial resistance to even the most advanced and most widely used antibiotics is a problem of increasing importance. The most important class of antibiotics, in terms of selectivity and safety, are the ß-lactams which was used to be very effective in curing bacterial infections. As a resistance mechanism microorganisms developed degrading enzymes able to inactivate those antibiotics - ß-lactamases. Presently there are over 300 ß-lactamases found in bacterial species and this number is still growing due to the excessive usage of ß-lactams.
A more recent group of these numerous enzymes is represented by metallo-ß-lactamases which contain zinc ions as naturally occurring metal. They are potentially very dangerous because they are produced by many bacterial species and exhibit very broad substrate profile, including the most recent ß-lactams, which are often considered as last-resort agents for curing diseases caused by multi-drug resistant isolates.
However, despite ß-lactamases importance, their structure-function relationships are very partially understood and their evolutionary history remains unclear, as well as the mechanism of acquisition and the origin of metallo-ß-lactamase determinants.
Recently post-genomic approach revealed numerous metallo-ß-lactamases homologues in clinically relevant bacteria. Investigation of the biochemical profiles and the genetic background of those homologues could give important clues of metallo-ß-lactamases evolution and function.

Goals:

1. screening all available microbial genomes in order to detect metallo-ß-lactamases homologues,
2. selection of the most appropriate targets (highest homology, relevance of bacterial species) – 4-5 species,
3. cloning metallo-ß-lactamase homologous genes into appropriate vectors,
4. investigating metallo-ß-lactamase activity and possible other functions of found homologues,
5. investigate the potential role of metallo-ß-lactamase homologues as progenitors of clinically relevant enzymes (directed evolution),
6. investigating possibilities of homologues becoming active metallo-ß-lactamases - determining the least number of mutations leading from inactive homologue to active enzyme (directed evolution),expression of gene, protein production and characterisation in case of detecting new bacterial species having metallo-ß-lactamase activity.