Dr. Marta Valentini (Siena, 1971)
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RELAZIONE ANNUALE - Primo Anno di Corso (1999-2000)
Nel corso del 1° anno di dottorato la dott.ssa Marta Valentini si è inserita in una linea di ricerca già attiva, finalizzata alla valutazione dell'equilibrio redox cellulare quale meccanismo di controllo su importanti eventi biologici come la traduzione del segnale, l'espressione genica, la risposta a stimoli proliferativi e apoptogeni. E' noto che le specie ossidanti (sia endogene che esogene), sono in grado di influenzare lo stato redox di proteine, inducendo modificazioni post-traduzionali principalmente sui residui di cisteine.
L'obbiettivo di questo studio, che è già stato recentemente pubblicato (1), è stato quello di caratterizzare gli effetti proossidanti derivanti dall'attività della g-glutamil transpeptidasi (GGT) di membrana in cellule di melanoma umano Me665/2 (clone 60 e 21), che presentano, pur derivando dalla stessa linea metastatica, una molto diversa espressione di GGT (84.7 e 0.2 mU/mg di proteina, rispettivamente). Questo parametro correlata con una serie di altri parametri precedentemente valutati, che indicano tutti un maggiore potenziale invasivo (una maggiore malignità) del clone 60 rispetto alla controparte clone 21.
L'effetto proossidante della GGT, precedentemente caratterizzato nel nostro laboratorio in altre linee cellulari tumorali (2), può essere annoverato tra le fonti fisiologiche di specie attive dell'ossigeno (ROS): dal metabolismo extracellulare del GSH, che costituisce la funzione canonica della GGT, si produce cisteinil-glicina che, per il suo pKa di 6.4 (più basso di quello del GSH 8.6), si ritrova al pH fisiologico dei compartimenti extracellulari, prevalentemente sotto forma di anione tiolato; questo va facilmente incontro a reazione di Fenton con produzione di radicali tiili, anione superossido e, per dismutazione, H2O2.
Nel nostro modello dei due cloni di melanoma abbiamo dimostrato che fornendo concentrazioni ottimali dei due substrati della GGT (GSH come donatore e glicil-glicina come accettore di glutamili), ossia stimolando l'enzima, il clone 60 (GGT +) produce una significativa quantità di H2O2 rispetto al clone 21 (GGT-). Tale produzione di H2O2 viene ulteriormente incrementata in presenza di superossido dismutasi (SOD), mentre viene significativamente diminuita in presenza dei due inibitori, acivicina e serina/ac. borico: Per il clone 21 (GGT-) non si evidenziano variazioni statisticamente significative. La produzione extracellulare di H2O2 influenza lo stato redox dei tioli proteici della superficie cellulare, infatti la stimolazione della GGT produce una perdita significativa dei gruppi &endash;SH nel clone 60; questa diminuzione viene prevenuta sia inibendo l'enzima con acivicina che in presenza di catalasi,; inoltre in presenza dell'inibitore acivicina si osserva un guadagno dei tioli ridotti anche in assenza di stimolazione. Per il clone 21 non si evidenziano variazioni statisticamente significative.
E' stato inoltre valutato lo stato di attivazione del fattore NF-kB, noto essere redox-sensibile e coinvolto nell'espressione di numerosi geni implicati in una ampia gamma di risposte biologiche. L'attivazione di NF-kB (valutata tramite immunoblot della subunità p65 traslocata nel nucleo) è già costitutivamente maggiore nel clone 60 (GGT+) rispetto al clone 21; inoltre la stimolazione della GGT nel clone 60 porta ad attivazione di NF-kB e, parallelamente, l'inibizione di GGT produce disattivazione di NF-kB.
L'espressione di GGT è considerata un marker di progressione neoplastica, infatti risulta essere estremamente elevata in una grande varietà di tumori spontanei e sperimentali. D'altra parte, numerosi studi sottolineano la correlazione tra attivazione di NF-kB ed espressione di numerosi prodotti genici che contribuiscono all'invasività neoplastica. I nostri dati suggeriscono che l'attività della GGT, tramite produzione extracellulare di H2O2 si ripercuote sullo stato redox dei tioli superficiali (che risultano ossidati) e sull'attivazione di NF-kB (che risulta incrementato). Date queste premesse della letteratura e alla luce dei nostri dati sperimentali, si può supporre che questo meccanismo di natura ossidativa, contribuisca a determinare il fenotipo più maligno del nostro clone 60 di melanoma e, in generale, delle cellule tumorali, che esprimono GGT.
La nostra linea di ricerca si è inoltre indirizzata a valutare la risposta cellulare dei due cloni ad uno stimolo ossidativo tossico (90mM di H2O2 per 24 ore). La vitalità cellulare, intesa come integrità della membrana e misurata come esclusione del Trypan Blue, rimane ben conservata nel clone 21 rispetto al controllo, mentre nel clone 60 è drasticamente diminuita, sia nelle cellule ancora adese sia in quelle distaccate dal monostrato.
La morfologia nucleare, valutata in microscopia a fluorescenza con un intercalante del DNA (Hoechst 33258), nel clone 21 mostra i tipici parametri di apoptosi (condensazione e marginazione della cromatina, intensa fluorescenza, ridotto volume nucleare, presenza di corpi apoptotici) che sono invece assenti nel clone 60. Questa morfologia è confermata dalla attivazione delle caspasi di tipo 3, una classe di cistein-proteasi che, con meccanismo a cascata, vengono attivate in numerosi modelli di apoptosi. L'attività delle caspasi-3 è estremamente elevata nelle cellule distaccate del clone 21, appena aumentata nelle cellule distaccate del clone 60. Il tipico clivaggio della poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), operato dalle caspasi-3 attivate, è presente esclusivamente nelle cellule distaccate del clone 21.
In sintesi, uno stimolo di natura ossidativa induce apoptosi nel clone 21 e necrosi nel clone 60. I fattori responsabili di tale diversa risposta possono essere ovviamente molteplici. Tra questi, un parametro differenziale tra i due cloni che abbiamo preso in considerazione è l'espressione della proteina Bcl-2, considerato il principale regolatore negativo dell'apoptosi. Paradossalmente, questa molecola antiapoptotica per antonomasia, è ben espressa proprio nel clone 21 che va incontro ad apoptosi, mentre è assente nel clone 60. Dati preliminari indicano un potenziale ruolo di Bcl-2 nel favorire, anziché prevenire, la morte cellulare per apoptosi.
(1) Maellaro E., Dominici S., Del Bello B., Valentini M.A:, Pieri L., Perego P., Supino R., Zunino F., Lorenzini E., Paolicchi A., Comporti M., Pompella A. (2000) Membrane gamma-glutamyl transpeptidase activity of melanoma cells: effects on cellular H2O2 production, cell surface protein thiol oxidation and NF-kB activation status. J.Cell Sci. 113, 2671-2678.
(2) Dominici S., Valentini M., Maellaro E., Del Bello B., Paolicchi A., Lorenzini E., Tongiani R., Comporti M., Pompella A. (1999) Redox modulation of cell surface protein thilos in U937 lymphoma cells: the role of y-glutamyl transpeptidase-dependent H2O2 production and S-Thiolation. Free Rad. Biol. Med. 27, 623-635.