Dr. Monia Carlini (Chianciano T., Siena, 1969)
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RELAZIONE ANNUALE - Primo Anno di Corso (1999-2000)
L' attività di ricerca condotta nel corso del 1° anno di Dottorato è stata rivolta ad approfondire uno degli aspetti, non ancora adeguatamente dimostrato, concernenti i meccanismi coinvolti nel determinismo delle principali patologie neonatali in corso di stress ossidativo: il ruolo del ferro libero e della sua azione proossidante. Uno stress ossidativo interviene ogni qualvolta si verifichi uno sbilanciamento del delicato equilibrio tra fattori proossidanti e sistemi antiossidanti, o per una sovraproduzione dei primi o per carenza dei secondi. Entrambe queste condizioni sono evenienze frequenti nel neonato, soprattutto se pretermine oin condizioni cliniche compromesse L'importanza del ferro è ben nota per il suo coinvolgimento in un gran numero di processi metabolici quali reazioni di sintesi, detossificazione difese antibatteriche, trasporto e utilizzazione dell' ossigeno. E' stato infatti dimostrato che la carenza di ferro durante i primi stadi di sviluppo del sistema nervoso centrale pu associarsi ad alterazioni comportamentali, quali deficit della concentrazione e della memorizzazione mediati dall' ippocampo; in altri distretti può influenzare negativamente la produzione di energia cellulare con compromissione della funzionalità dell' organo interessato. Il ferro, però, in virtù della sua capacità di passare rapidamente dallo stato ferroso allo stato ferrico, a seconda delle molecole con cui interagisce, può diventare una potente sostanza ossidante o riducente. In condizioni di normalità è sequestrato in proteine di trasporto quali la transferrina e la lactoferrina e immagazzinato in proteine di deposito, quali la ferritina ed l' emosiderina. In situazioni di sovraccarico la trasferrina satura i suoi siti di legame e ferro libero si rende disponibile a reagire con l' ossigeno e produrre radicale ossidrile, il più potente agente ossidante del sistema biologico. Similmente condizioni di acidosi e/o ischemia determinano rilascio di ferro dalla transferrina e attivazione delle stesse reazioni (Haber-Weiss e Fenton) che conducono alla produzione di RL.
Gli elementi primi testimoni dell' ossidazione sono gli idroperossidi (TH) che si formano per l' azione di deidrogenazione e successiva perossidazione da parte de radicale ossidrile OH. La determinazione delle concentrazioni plasmatiche di TH fornisce indicazioni utili sull' evenienza di uno stress ossidativo, essendo essi prodotti intermedi del processo ossidativo su lipidi, proteine e aminoacidi. La determinazione dei livelli plasmatici dei prodotti avanzati di ossidazione proteica (AOPP) è utile invece per far luce sulle interazioni RL-proteine, fino ai prodotti finali di degradazione proteica, privi di qualsiasi potere ossidante.
Sulla base delle suddette considerazioni scientifiche all' inizio del corrente anno accademico si è intrapreso uno studio teso a valutare nel neonato pretermine i rapporti tra stress ossidativo fetale, produzione di RL e danno tissutale. La nascita di per se comporta uno stress ossidativo per il passaggio dalla vita intrauterina, ambiente relativamente ipossico (PaO2 =20-25 mmHg), alla vita extrauterina ove la concentrazone di ossigeno è circa 6-7 volte più elevata. E' stato pertanto calcolato il rilascio di ferro libero all' interno degli eritrociti di cordone ombelicale, lavati, risospesi in una soluzione tampone, e posti in incubazione aerobica per 24 ore a 37° C. Sono stati poi determinati i livelli di ferro libero anche nel plasma. L'entità del danno conseguente alla formazione di RL in seguito allo stress ossidativo è stato valutato mediante la determinazione delle concentrazioni plasmatiche degli AOPP, quali molecole terminali della reazione a catena, prive di ulteriori capacità ossidanti.
Sono stati arruolati 54 neonati (24 pretermine e 30 a termine rispettivamente EG = 29.0 ± 3.7 e 39.6 ± 1.5; Peso alla nascita = 1230 ± 570 e 3220 ± 550) consecutivamente ammessi in Terapia Intensiva Neonatale, presso l'Istituto di Pediatria Preventiva e Neonatologia dell'Università di Siena, nel periodo 1 Gennaio 1999- 1 Gennaio 2000. Campioni di sangue eparinato sono stati prelevati dalla vena ombelicale subito dopo la nascita, al momento del clampaggio del cordone. I globuli rossi, lavati, sono stati risospesi in una soluzione tampone (pH 7.4), quindi posti in incubazione aerobica a 37°C per 24 ore. Il ferro libero è stato valutato nel plasma al tempo 0, negli eritrociti al tempo 0 e alla fine dell'incubazione. Il rilascio di ferro libero è stato calcolato come differenza tra i due tempi. Gli AOPP sono stati determinati con metodo spettrofotometrico in tutti i neonati. Tutti i dati, espressi come medie + SD, sono stati analizzati utilizzando il pacchetto statistico internazionale SPSS/PC +4 per effettuazione di test t di Student e correlazioni lineari.
Sia nei neonati a termine che nei pretermine si verifica un aumento del contenuto di ferro libero intraeritrocitario al termine dell' incubazione rispetto al tempo 0 (neonati pretermine = 2.51 + 1.73 vs 12.08 + 4.84, p < 0.0001 nmol/ml, neonati a termine = 2.44 + 1.94 vs 12.57 + 7.32, p < 0.0001 nmol/ml). Sono state osservate correlazioni statisticamente significative tra livelli plasmatici di ferro libero e: età gestazionale (r = 0.46, p = 0.003, n =54), peso alla nascita (r = 0.36, p = 0.03, n = 54), pH del sangue del cordone (r = -0.68, p < 0.0001, n=36), eccesso basi del sangue del cordone (r = -0.63, p < 0.0001, n=36), rilascio di ferro libero intraeritrocitario al termine dell' incubazione (r = 0.42, p =0.01, n=31) in tutti i neonati; e tra livelli plasmatici di ferro libero e AOPP nei nati pretermine (r = 0.49, p =0.02, n=21).
La nostra indagine, dimostra un aumento significativo del rilascio di ferro libero negli eritrociti alla fine di un incubazione aerobica. Maggiore è il rilascio di ferro libero dagli eritrociti, più alti risultano essere i livelli di ferro libero nel plasma. A sua volta il ferro libero plasmatico correla in maniera statisticamente significativa con le condizioni cliniche del bambino alla nascita, rilevabili dai valori di pH ed eccesso basi. E' interessante notare come il ferro libero intraeritrocitario e plasmatico aumenta nelle stesse situazioni in cui è stato dimostrato verificarsi un incremento dei TH e AOPP. L' incremento dei prodotti di degradazione ossidativa proteica e la loro correlazione con il ferro libero nel plasma suggerisce che tanto maggiore è lo stress ossidativo, tanto più si producono metaboliti reattivi dell' ossigeno, e tanto maggiore è il rischio di stress ossidativo nei neonati con asfissia alla nascita. Ancora più importante è la considerazione che l'eritrocita può essere coinvolto direttamente nel danno cellulare mediato da radicali liberi, in quanto è noto che il primo stadio del danno di membrana è garantito dalla presenza di ferro libero, quale importante catalizzatore di reazioni ossidative.
Questi risultati portano ad importanti riflessioni che possono essere ultilizzate come punto di partenza di ulteriori indagini. Il primo suggerimento è l' utilità dell' accertamento e del monitoraggio del processo di emolisi che interessa il neonato pretermine, e in particolare il nato asfittico. E' probabile, per quanto non ancora dimostrato, che il ferro libero intraeritrocitario sia responsabile della ridotta emivita del globulo rosso. Il ferro libero infatti è direttamente coinvolto nel danno ossidativo di membrana. Da questo scaturisce il secondo suggerimento della possibilità di considerare l' eritrocita come valido marker di stress ossidativo neonatale.
Lungi dal risolvere il dilemma delle complesse relazioni che intercorrono tra ipossia, rilascio di ferro intraeritrocitario, generazione di RL e possibile danno ossidativo, i risultati della presente ricerca inducono a formulare l' ipotesi che lo stress ossidativo che si verifica alla nascita è responsabile di un' aumentato rilascio di ferro libero non solo all' interno del globulo rosso ma anche nel plasma e, conseguentemente, di un aumentato rischio di danno ossidativo in cui anche le proteine plasmatiche sono coinvolte. Questo è particolarmente importante per il neonato pretermine, che non ha ancora sviluppato pienamente le sue potenzialità antiossidanti.
La banca dati in possesso alla dimissione è stata arricchita dai risultati dal programma di follow-up previsto fino a due anni per tutti i neonati ricoverati nel reparto di Terapia Intensiva Neonatale. Un follow-up così programmato ha lo scopo di fornire la prognosi di un eventuale fattore di rischio e relativo trattamento e quindi la prospettiva per una razionale politica sanitaria ed inoltre ha il fine di individuare, valutare ed eventualmente trattare precocemente l'handicaps con istruzione dei genitori alla cura del bambino.
Per conseguire tale risultato è importante tenere conto dei fattori di rischio e della loro gravità; quindi abbiamo considerato ad altissimo rischio (categoria A) i neonati con peso alla nascita inferiore a 1500gr. o che abbiamo manifestato:
- Encefalopatia ipossico-ischemica; Alterazioni cerebrali evidenziate con tecniche per immagini; Esame neurologico alterato; Persistenti anomalie nei tracciati elettroencefalografici; Convulsioni; Malattia polmonare cronica; Ventilazione assistita prolungata
Questi bambini sono seguiti mensilmente fino al I^ anno di vita con una valutazione dell'accrescimento, esame neurologico, visita oculistica, E.E.G., ed inoltre TAC e RMN secondo necessità. Dopo il I^ anno fino all'età scolare vengono effettuati controlli più distanziati allo scopo di valutare l'acquisizione delle tappe motorie lo sviluppo cognitivo e le capacità relazionali, attraverso test psicometrici e colloqui con lo psicologo che hanno lo scopo di fornire anche un sostegno alla famiglia. I bambini con un peso alla nascita superiore a 1500gr. e con patologie che consentono una rapida dimissione dalla T.I.N. rappresentano la categoria B In questo caso per evitare dispendio di risorse i controlli effettuati con le stesse modalità sono più distanziati nel tempo rispetto ai primi. La sottoscritta dott.ssa Monia Carlini, in questa fase del programma di ricerca, oltre alla mansione di organizzazione dei dati anamnestici ha partecipato attivamente al lavoro di ambulatorio, elaborando i dati ottenuti. Per ciò che riguarda il follow-up dei 54 neonati , 24 pretermine e 30 a termine, arruolati per la ricerca, il follow-up non ha messo in evidenza nessuna patologia , tutti i pazienti hanno presentato normale esame ecografico cerebrale a 6 mesi ed appropriata acquisizione delle tappe neurocognitive corretta per l'età gestazionale.
In sintesi, nel corso di questo primo anno di dottorato di ricerca, particolare attenzione è stata rivolta alla valutazione dello sviluppo del sistema nervoso centrale ed all'insorgenza di malattie neurologiche correlandole ai markers dello stress ossidativo tramite un'attenta e rigorosa analisi statistica dei dati.