Abstract della Tesi di Dottorato

Sviluppo e caratterizzazione di cellule di carcinoma del colon di origine umana resistenti al metotrexato e loro impiego per la valutazione dell'attivita' antineoplastica di nuovi antifolici

Dottoranda: Dott.ssa Barbara Caciagli
Tutore: Prof. Enrico Mini, Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica, Università degli Studi di Firenze

Nuovi antifolici caratterizzati da proprietà farmacologiche diverse dal prototipo (metotrexato, MTX) possono agire come inibitori selettivi di cellule tumorali MTX-resistenti (1). Sono state selezionate due linee cellulari di carcinoma del colon di origine umana (DLD-1/MTX-1 e DLD-1/MTX-2) resistenti al MTX al fine di caratterizzare i meccanismi responsabili di questo fenomeno e valutare l'attività citotossica di nuovi antifolici. Dopo esposizione farmacologica di 72 h le due linee cellulari hanno mostrato resistenza di alto grado al MTX (rapporto di resistenza pari a circa 100 e 110 rispettivamente per le cellule DLD-1/MTX-1 e DLD-1/MTX-2) e resistenza crociata nei confronti di antifolici inibitori della timidilato sintasi (TS) internalizzati mediante il carrier per i folati ridotti (RFC) (il raltitrexed, un antifolico poliglutammilabile e lo ZD9331, non soggetto a poliglutammilazione). Tali linee cellulari sono risultate invece sensibili nei confronti degli antifolici inibitori della TS lipofili e non poliglutammilabili (AG337 e trimetrexato). Una resistenza crociata soltanto parziale (di basso grado) è stata osservata con il CB3717, un antifolico inibitore della TS che viene internalizzato principalmente mediante il recettore di membrana per l'acido folico (MFR). Per meglio studiare il ruolo della poliglutammilazione nell'insorgenza della resistenza sono stati determinati gli effetti inibenti la crescita cellulare dopo esposizione di breve durata (4 ore) agli antifolici: i valori dell'indice di resistenza delle linee cellulari DLD-1/MTX-1 e DLD-1/MTX-2 nei confronti del MTX e del raltitrexed sono risultati maggiori rispetto a quelli osservati dopo esposizione di 72 h, mentre quello per ZD9331 è minore. Il TMTX e l'AG337 sono risultati invece ugualmente attivi nei confronti di tutte e tre le linee cellulari anche dopo trattamento farmacologico di breve durata.
L’attività specifica della DHFR, dell’enzima metabolizzante folilpoliglutammato sintetasi (FPGS) e della TS sono risultate simili nella linee sensibili al  MTX e in quelle resistenti. E' stato inoltre osservato un accumulo del MTX ridotto ed un efflusso dell'antifolico più rapido nelle linee resistenti rispetto alla linea parentale sensibile. In entrambe le linee cellulari resistenti questi risultati sono associati alla riduzione dei livelli di mRNA del carrier RFC, all'incremento di quelli di MFR ed all'incremento dei livelli proteici della isoforma 1 della proteina di membrana associata alla polichemioresistenza (MRP1) rispetto alla linea cellulare sensibile. E' stata inoltre osservato che nella linea parentale sensibile DLD-1 il MTX è presente intracellularmente soprattutto come specie poliglutammiche, mentre nelle due linee resistenti esso è presente quasi totalmente in forma monoglutammica. I livelli intracellulari totali dei folati ridotti sono inoltre più bassi nelle due linee MTX-resistenti rispetto alla parentale sensibile.
Questi risultati dimostrano che vari meccanismi sono responsabili delle resistenza al MTX nella linee cellulari DLD-1/MTX-1 e DLD-1/MTX-2. Tali meccanismi sono rappresentati da una riduzione del trasporto del MTX dovuta ad una diminuita espressione del carrier RFC, un aumento dell’efflusso dell’antifolico dovuto sia alla diminuita ritenzione dei poliglutammati che all'incremento dei livelli proteici di MRP1. Le linee cellulari tumorali resistenti al MTX possono rappresentare un modello oncologico in vitro utile per lo screening di nuovi antifolici potenziali inibitori di tumori resistenti al MTX.
Bibliografia:
1. Danenberg P.V. et al. (1999) Sem. Oncol. 26(6): 621-631.

Abstract in english
Development and characterization of methotrexate (MTX) resistance mechanisms in human colon carcinoma cells and evaluation of the cytotoxic activity of new antifolates

Ph.D. Student: Barbara Caciagli
Tutor: Prof. Enrico Mini, Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica, Università degli Studi di Firenze

Novel antifolate inhibitors with pharmacological properties different from MTX may act as selective inhibitors of MTX-resistant tumor cells (1). Two human colon carcinoma cell lines (DLD-1/MTX-1 and DLD-1/MTX-2) resistant to MTX were developed to study the mechanisms of this phenomenon and to evaluate cytotoxic activities of new antifolates. These cells were highly resistant to MTX (resistance ratios of about 100 and 110 in DLD-1/MTX-1 and DLD-1/MTX-2 cell lines, respectively) and antifolate thymidylate synthase (TS) inhibitors transported via the reduced folate carrier (RFC), regardless of their substrate properties for folylpolyglutamate synthetase (FPGS) (e.g. raltitrexed, a polyglutamatable antifolate, and ZD9331, a non-polyglutamatable one) following a 72h exposure. They were sensitive to lipophilic and non-polyglutamatable antifolates (AG337 and trimetrexate). Low grade cross-resistance was observed with CB3717, a TS inhibitor transported via the membrane folate receptor (MFR). Following a short-term 4 h exposure (allowing a more precise indication of  the role of polyglutamylation in determining cytotoxic effects), the resistance ratios for MTX in the DLD-1/MTX-1 and DLD-1/MTX-2 cells as compared to sensitive parental cells were higher (about 290- and 380, respectively). The resistance ratios for raltitrexed were also increased while they were lower for ZD9331. Sensitivity patterns of trimetrexate and AG337 were instead similar between the two different treatment schedules. Dihydrofolate reductase, FPGS and TS activities were not substantially different in MTX-resistant and sensitive cells. Significant reduction in [3H]MTX uptake and increase of [3H]MTX efflux appeared in MTX-resistant cells, compared to sensitive cells. These findings were associated with reduced RFC mRNA levels and increased MFR (mRNA levels) and multidrug resistance protein isoform 1 (MRP1) (protein levels) expression in both resistant cells. A prevalence of polyglutamylated MTX species in the sensitive cell line and of MTX monoglutamate in the resistant cell lines was observed. Analysis of steady-state levels of total reduced folate pools revealed a significant reduction in the DLD-1/MTX-1 and DLD-1/MTX-2 cells as compared to parental cells. MTX resistance in DLD-1 cells involves multiple mechanisms, including decreased accumulation via RFC, increased efflux due to reduced polyglutamate retention and increased MRP1 expression. These cell lines may help screen new antifolate inhibitors of MTX-resistant tumors.

References:
1. Danenberg P.V. et al. (1999) Sem. Oncol. 26(6): 621-631.