Programma formativo

Primo anno

Durante il primo anno i dottorandi svolgono un intenso programma per l'apprendimento delle numerose e complesse metodiche da usare durante il biennio successivo per svolgere il lavoro di ricerca sperimentale. Ciò non esclude che sin dal primo anno, dopo un periodo di apprendistato più o meno breve, il dottorando possa partecipare al lavoro di ricerca. La formazione avviene mediante: a) Didattica formativa. b) Apprendimento di metodiche sperimentali. c) Esperimenti preliminari. Le metodiche sperimentali di fondamentale importanza che sono insegnate sono le seguenti: a) Conservazione e propagazione di colture cellulari di vario tipo con particolare attenzione al mantenimento della sterilità. Le colture di cellule primarie vengono effettuate utilizzando linfociti, monociti, eritrociti, granulociti, cellule endoteliali (previa separazione dai cordoni ombelicali umani), varie popolazioni cellulari del SNC (neuroni, astrociti, oligodendrociti, ecc.). Inoltre la tecnica è estesa a cellule di linea quali U-937, linfoma umano; JURKAT, linfoma umano; Hep G2, epatoma umano; U-373 MG, astrocitoma umano; IMR-32, neuroblastoma umano; HL60, trofoblasto umano da espianti tissutali. b) Tecnica di esclusione di un colorante vitale (Trypan blu). Tecniche di valutazione della vitalità e della proliferazione cellulare usando (3-[4,5-Dimetiltiazol-2-yl]2,5-difeniltetrazolio bromide; Tiazolil blue) (MTT), oppure bromodesossiuridina (BrdU), Alamar blu, altri metodi fluorimetrici (Hoechst e fluoresceina) oppure più raramente timidina triziata. c) Preparazione di soluzioni chimiche anche complesse e allestimento e sterilizzazione dei terreni di coltura. d) Apprendimento di metodiche spettrofotometriche e spettrofluorimetriche. e) Misura del Ca2+ intracellulare con metodi fluorimetrici su cellule libere o aderenti. f) Messa a punto di tecniche bioluminescenti atte a valutare la generazione di ossidanti. g) Saggi sia biologici che immunoenzimatici (ELISA) per la valutazione della concentrazione di citochine sia nel plasma o nei supernatanti di colture cellulari. Valutazione tramite Kit ELISA, kit RIA e tecniche di immunodiffusione radiale di vari tipi di ormoni ed in generale di fattori di natura proteica. h) Preparazione di frazioni subcellulari. i) Preparazione di sinaptosomi di ratto. l) Valutazione della respirazione mitocondriale tramite elettrodo a ossigeno. m) Apprendimento di tecniche preparative ed analitiche per l'isolamento e la purificazione di proteine, tramite metodiche elettroforetiche e cromatografiche. n) Valutazione quantitativa e qualitativa di apoptosi cellularre mediante kit specifici e DNA elettroforesi. o) Metodica del patch-clamp per studi di elettrofisiologia e della struttura-funzione dei canali ionici. p) Metodiche di estrazione e manipolazione di acidi nucleici, amplificazione di acidi nucleici mediante reverse-transcriptase PCR, metodiche di ibridizzazione di acidi nucleici (Northern e Southern blotting), Western blotting, autoradiografia, ribonuclease protection assay, DNA fragmentation assay. q) Valutazione quantitativa dell'espressione di: proteine regolatrici del ciclo cellulare come ciclina, chinasi ciclino-dipendenti (CDKs) e inibitori delle CDKs (M6, P21, P27); protooncogeni (bcl2, bclx, cmyc-cfas e bax); proteine associate all'apoptosi (p53 e GADD45); proteine associate all'angiogenesi (recettori delle trombine, VEGFs, FLYI, FLT4, TIE2, CD31 ed angiopoietine); citochine: IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IFNgamma, IL-5, IL-9, IL-13, IL-14, IL-15. Altre metodiche ancora più specialistiche possono essere messe a punto se necessario per svolgere un particolare programma di ricerca.

Secondo anno

Durante il secondo anno ciascun dottorando deve preparare e presentare ai docenti almeno due seminari per ciascun anno, su argomenti correlati al programma di ricerca. In tal modo il dottorando impara a fare una ricerca bibliografica, a condensare ed ordinare gli argomenti rilevanti, a presentarli in forma organica ed a discuterli con i vari docenti. Gli argomenti trattati sono vari e rispecchiano sia il motivo centrale del dottorato che l'argomento di ricerca sviluppato dal dottorando: 1) Interazione ligando-recettore e trasduzione del segnale: 2) Fisiologia della matrice extracellulare. 3) Il ruolo di varie citochine sul processo di cicatrizzazione. 4) Tecniche di biologia molecolare per lo studio delle proprietà delle membrane eccitabili. 5) Biologia molecolare dei canali ionici e recettori di membrana. 6) Plasticità neuronale e modulazione postsinaptica. 7) Rigenerazione neuronale e fattori di crescita assonale. 8) Ruolo del calcio nei processi neurosecretori. 9) Morfologia e funzionalità del sistema nervoso centrale e periferico di mammifero. 10) Tecniche di misura della secrezione ormonale. 11) La modulazione della funzione astrocitaria da parte delle neurotrofine. 12) Rapporto struttura/funzione dei canali del cloro. 13) Attività e tossicità di agenti fisici e chimici su cellule endoteliali in coltura. 14) Processi fisiopatologici del SNC. 15) Biologia cellulare del nucleo e rilevanza del nucleolo. 16) Apoptosi e necrosi. 17) Immunologia della riproduzione. 18) Citochine proinfiammatorie ed immunosoppressive. 19) Enzimi metabolizzanti i glucocorticoidi e loro ruolo nel controllo della specificità della risposta ormonale nei tessuti bersaglio. Inoltre i dottorandi sono tenuti a seguire altri seminari, conferenze e convegni sui temi pertinenti sia in sede che fuori. Ciò è importante perché, il confronto con altri colleghi e tematiche, sviluppa il senso critico e la selezione di argomenti. Durante questo anno il dottorando inizierà la preparazione della ricerca che sarà oggetto della tesi, con il coordinamento del proprio supervisore indicato dal Collegio del Dottorato. Ciò potrà avvenire sia presso la sede che presso altre sedi universitarie straniere collegate.

Terzo anno

Anche nel terzo ed ultimo anno ciascun dottorando deve preparare e presentare ai docenti almeno due seminari, su argomenti particolarmente correlati al programma di ricerca. Durante il 3° anno l'attività prevalente risulterà comunque lo sviluppo del proprio progetto di ricerca che sarà oggetto della tesi finale. A tal proposito si precisano le principali linee di ricerca seguite dal dottorato: Fisiologia delle citochine come regolatori della omeostasi cellulare in condizioni fisiologiche, nella denutrizione e durante l'invecchiamento. Relazione tra citochine, sistema endocrino e nervoso. Metabolismo delle proteine plasmatiche e cellulari. Relazione tra proteine amiloidogeniche, fibrillogenesi ed amiloidosi. Studio delle membrane cellulari e dei relativi componenti nell'invecchiamento cellulare. Studio del turnover della matrice extracellulare. Caratterizzazione, regolazione e modulazione di singoli canali ionici in neuroni centrali e periferici. Ruolo e diversificazione delle proteine G nella modulazione di segnali ormonali mediati da recettori di membrana. Identificazione di subunità strutturali di canali ionici e loro funzionalità mediante anticorpi monoclonali. Analisi dei meccanismi di integrazione somatica sensitivo-motoria. Regolazione delle conduttanze ioniche astrocitarie da parte di neurotrasmettitori e neuromodulatori. Meccanismi molecolari della secrezione di neurotrofine in astrociti di ratto. Alterazione delle proprietà di membrana correlate con patologie del sistema nervoso centrale. Induzione degli enzimi antiossidanti (GSH perossidasi, catalasi, superossido dismutasi) delle heat stress proteins (HSP 70eu) dell'emo ossigenasi durante l'adattamento allo stress ossidativo cronico inducibile in pazienti con varie patologie (ischemiche, neurodegenerative ed infettive croniche) mediante autoemoterapia controllata e previa esposizione del sangue ad ossigeno-ozono. Studio delle modificazioni delle membrane dell'omeostasi ionica, della proliferazione e differenziamento cellulare dopo esposizione a onde elettromagnetiche.