Linee di Ricerca del Prof. Salvatore Oliviero  

Allo scopo di identificare geni regolati dall'oncogene c-fos abbiamo utilizzato fibroblasti di topo mutati nel locus c-fos. L'RNA estratto da fibroblasti mutati e w.t. nel locus c-fos sono stati analizzati mediante la tecnica "RNA differential display". LA comparazione di espressione nei due cloni cellulari ci ha permesso di identificare un nuovo gene espresso in dipendenza di c-fos. Questo gene codifica per un fattore di crescita e lo abbiamo chiamato "c-fos-induced growth factor" (FIGF). FIGF è una molecola secreta in grado di dimerizzare ed ha attività mitogenica su fibroblasti di topo. Cellule che sovraesprimono FIGF acquisiscono una morfologia alterata: si allungano, diventano più rifrangenti e  tendono a staccarsi dalla piastra di coltura. FIGF appartiene alla famiglia dei fattori di crescita del "platelet-derived growth factor" PDGF, ma a differenza di questo la sua espressione è dipendente da c-fos in vitro. Analisi dell'espressione di FIGF in embrioni di topo ha rivelato che FIGF è principalmente espressso nei mesenchimi degli abbozzi degli arti e nel polmone. Abbiamo anche clonato l'omologo umano di FIGF e determinato la sua localizzazione cromosomica. Nel laboratorio stiamo anche procedendo alla caratterizzazione di due nuovi geni che sono indotti mediante il trattamento con siero in fibroblasti murini. Uno di questi geni è espresso principalmente nel sistema nervoso e non presenta similitudini con geni noti, mentre il secondo codifica per l'omologo murino del gene della caseina chinasi alfa.

Questo progetto ha lo scopo di identificare gli elementi responsabili dell'attivazione trascrizionale del gene della distrofina umana che è espresso preferenzialmente nelle cellule muscolari scheletriche e cardiache. L'analisi dei    mutanti ha rivelato che nel promotore minimo sono presenti due elementi essenziali per la sua espressione. Il primo elemento è riconosciuto dal fattore trascrizionale SRF (Serum Responsive Factor). SRF è un fattore ubiquitario per cui la specificità trascrizionale del promotore della distrofina deve essere mediata anche da altre molecole. Abbiamo quindi analizzato il contributo trascrizionale di altri elementi presenti nel promotore della distrofia. La sequenza adiacente e parzialmente sovrapposta al sito di legame per SRF è riconosciuta da un nuovo fattore in grado di legare il DNA nel solco maggiore e piegarlo. Abbiamo chiamato questo nuovo fattore DPBF per "Dystrophin Promoter Bending Factor". Questa molecola probabilmente forma un complesso sul DNA con SRF e ne facilita la funzione di attivazione trascrizionale. Dai nostri dati appare che la trascrizione muscolo specifica, determinata dal promotore della distrofina, dipenda da un complesso trascrizione che si forma in corrispondenza della Cara box contenente il fattore ubiquitario SRF ed il fattore che si lega alla sequenza adiacente. Grazie alla piegatura operata sul DNA da parte di questo nuovo fattore SRF è probabilmente in grado di interagire con fattori muscolo-specifici che non legano direttamente il DNA.

Strumentazione e tecnologie utilizzate :

1. Tutti i progetti in laboratorio richiedono tecniche di manipolazione di DNA, clonaggio di geni, mutagenesi sito specifica, misura dei trascritti mediante Northern o RT-PCR.

2. Per lo studio della  regolazione trascrizionale in cellule eucariotiche  si usano tecniche standard di colture cellulari, trasfezione DNA, saggi di interazione DNA-proteine.

3. Per lo studio di fattori di crescita si usano tecniche per l'espressione di proteine ricombinanti in : batteri, lieviti e cellule CHO.

4. Purificazione di proteine ricombinanti mediante colonne di nichel, glutatione.