Linee di ricerca del Prof. Paolo Neri

La linea di ricerca consiste nell’analisi del repertorio di proteine espresse dal genoma di una cellula, mediante elettroforesibidimensionale computerizzata (2D-PAGE), e la successiva identificazione delle proteine separate. Vengono in tal senso impiegate tecniche di rivelazione come l’immunoblotting, seguito da chemiluminescenza, e di microsequenziamento delle componenti elettrotrasferite. Le informazioni strutturali ottenute mediante le tecnologie del proteoma vengono confrontate con quelle dedotte da sequenze di DNA contenute in banche dati, in modo da creare una correlazione biunivoca fra sequenze nucleotidiche (genoma) e mappe bidimensionali (preoteoma).

Strumentazioni e tecnologie utilizzate :

1. Sistema per 2D-PAGE Pharmacia LKB

2. Densitometro Laser Molecular Dynamics 300S

3. Sun Sparc Station 20 + Software Melanie 2d-Page II BioRad

4. Protein sequencer HP 241 + HPLC on-line HP 110

La linea di ricerca consiste, in generale, nel disegno e nella costruzione di strutture molecolari che siano in grado di mimare siti attivi di recettori e di leganti specifici (‘mimotopi’), mediante peptidi sintetici o anticorpi ricombinanti. Particolare interesse è dedicato ai mimotopi del sito colinergico del recettore nicotinico per l’importanza che quest’ultimo riveste, sia dal punto di vista dei meccanismi fisiopatologici e neurofarmacologici che del suo impiego diagnostico, come antigene nella serologia della Miastenia gravis. La linea include anche la costruzione, tramite anticorpi anti-idiotipo, di epitopi immunodominanti di proteine virali o di proteine “self” riconosciute da autoanticorpi. Tale obiettivo è perseguito tramite la produzione di anticorpi anti-idiotipo a partire da anticorpi specifici isolati da pazienti infettati o affetti da malattie autoimmuni.

  Strumentazioni e tecnologie utilizzate :

1. Biacore

2. Sintetizzatore automatico di peptidi su resina: Syro MultiSynTech

3. Sintetizzatore automatico di peptidi su cellulosa: Auto-Spot Robot ASP 222  

Linee di ricerca della Prof.ssa Anna Di Stefano

Peptidi  di differente lunghezza di sequenza derivata da quella della enterotossine stafilococciche (SE) relativamente alle regioni  coinvolte nel legame con le molecole MHC di classe II e con le regioni del TCR, saranno sintetizzati mediante sintesi multipla in fase solida. I peptidi opportunamente purificati e caratterizzati per la loro struttura saranno  saggiati per  il loro effetto sulla proliferazione  di  colture di linfomonociti di sangue umano periferico (PBMC) e sulla produzione di citochine, sia in condizioni basali che stimolati dalle tossine. I risultati ottenuti saranno valutati anche a livello atomico  sulla base dei dati strutturali disponibili per il complesso binario MHCII-SE. Oltre alle sequenze proprie delle tossine saranno anche sintetizzati varianti ottenute sostituendo ciascun residuo con un residuo  di alanina (alanine scanning).

L'antibody targeted chemotherapy è una  tecnica che usa anticorpi  coniugati con sostanze fotosensibili che diventano tossici solo dopo irraggiamento con luce di opportuna lunghezza d'onda. Scopo della ricerca è preparare nuovi tipi di fotosensibilizzatori, coniugarli con anticorpi ricombinanti e monoclonali e valutare se la morte indotta da tali fotosensibilizzatori sia liberi che coniugati  è dovuta ad una  risposta apoptotica delle cellule tumorali. L'apoptosi sarà valutata  qualitativamente  mediante elettroforesi su gel di agarosio e quantitativamente mediante analisi a citometria a flusso.

 Strumentazione e tecnologie utilizzate:

1. Camera sterile per colture cellulari, centrifughe, ultracentrifughe, spettrofotometri,  sistema per analisi della composizione in aminoacidi, sintetizzatore automatico di peptidi in fase solida, elettroforesi capillare, washer per piastre ELISA, lettore per piastre ELISA, BIAcore per l'analisi di interazioni biomolecolari, FACScan.

2. Colture cellulari, test di  citotossicità e di proliferazione cellulare; dosaggio ELISA delle citochine; dosaggio biologico del TNFa e dell'IFN g ; separazione del DNA intero e frammentato in gel di agarosio; test di valutazione  dell'apoptosi in citofluorimetria; dosaggi di attività enzimatiche.  

Linee di ricerca Dr.ssa Patrizia Soldani 

E’ un nuovo approccio alla terapia dei tumori che combina il riconoscimento specifico di antigeni tumore associati da parte degli anticorpi con l’azione di sostanze fotosensibilizzanti legate covalentemente all’anticorpo. In questo modo, in seguito a irradiazione con luce di appropriata lunghezza d’onda, si generano ossigeno singoletto e radicali liberi a brevissima vita media in prossimità della cellula da distruggere. Questa tecnica sta ricevendo un impulso considerevole dalla possibilità di produrre, per via ricombinante, frammenti anticorpali  (scFv) da librerie combinatorie fagiche. La linea di ricerca si propone di preparare immunoconiugati con sostanze fotosensibilizzanti modificate e scFv diretti contro antigeni presenti sulla superficie  di cellule tumorali nonché di valutarne l’efficacia mediante esperimenti ‘in vitro’. La valutazione preliminare dell’efficacia dei fotosensibilizzanti  modificati, ovviamente dopo coniugazione con gli agenti di targeting, viene effettuata mediante colture cellulari che esprimono sulla loro superficie gli antigeni per i relativi scFv in presenza dei coniugati con dosi note di energia. A tempi diversi, viene misurata la sopravvivenza delle cellule.

Parallelamente, viene valutata l’attivazione di processi iniziali apoptotici quali l’ aumento della  concentrazione dello ione calcio citosolico e l’esposizione al livello della membrana plasmatica della fosfatidilserina.

Vengano studiate le retinopatie diabetiche e tumori prostatici mediante scFv che legano markers di neovascolatura ottenuti da librerie combinatorie fagiche. Tale indagine viene condotta mediante tecniche di istochimica a partire da biopsie conservate in azoto liquido.

Strumentazioni e tecnologie utilizzate :

1. Microscopio Confocale a luce laser(MRC 600, BIORAD)

2. Spettofotometro

3. Strumento per irraggiamento selettivo di colture cellulari