PROGETTO FIRB – WP2

Universita’ degli Studi di Siena

Unita’ prof. Marina Ziche

PROGRESS REPORT: NOVEMBRE 2003

METODICHE

Dopo un’iniziale valutazione della citotossicita’, i biomateriali vengono caratterizzati per la capacita’ di indurre angiogenesi, vale a dire migrazione e proliferazione delle cellule endoteliali, e di promuovere l’adesione/sopravvivenza e funzionalita’ endoteliale a lungo termine.

Citotossicita’

E’ stato utilizzato il TRYPAN BLUE EXCLUSION TEST, incubando in provetta i materiali in studio con 200.000 o 400.000 cellule/ml sospese in terreno con 10% siero per 1-4 ore a 37C. L’HA e’ stata testata a 5, 50, 500 μg/ml sia mediante contatto diretto con le cellule in sospensione che indirettamente esponendo le cellule ad un gradiente di HA attraverso un filtro di policarbonato poroso.

Migrazione cellulare

La capacita’ della idrossiapatite in cristalli di indurre o modificare la migrazione endoteliale e’ stata valutata nelle camere di chemiotassi (Neuroprobe microchemotaxis chamber). In questo saggio le cellule in sospensione (12,500/50 ul) migrano verso un gradiente della sostanza in studio attraverso un filtro di policarbonato rivestito con proteine della matrice extracellulare, con pori di dimensioni note. E’ stato valutato l’effetto di HA da 10 a 500 μg/ml in assenza e in presenza del fattore angiogenico (vascular endothelial growth factor, VEGF). Per la condizione di controllo basale e’ stato utilizzato terreno con 0.1% siero, in grado di svelare effetti chemiotattici, mentre 10% siero viene considerata una condizione di stimolo migratorio aspecifico e massimale. Dopo 4 ore le cellule rimaste intrappolate nel filtro vengono fissate, colorate e contate. I dati vengono espressi come somma del numero delle cellule in chemiotassi (gia’ migrate sulla faccia inferiore del filtro) e in chemiocinesi (impegnate nel poro del filtro).

Attività proliferativa sul biomateriale

La capacità delle cellule di proliferare sui biomateriali è stata valutata utilizzando MTT CELL PROLIFERATION ASSAY. Tale test si basa sulla capacità delle cellule metabolicamente attive di trasformare, mediante una reduttasi mitocondriale, il composto solubile MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) in un sale del formazano insolubile che può essere determinato spettrofotometricamente. 4 ore prima della fine dell’esperimento si sostituisce il medium cellulare con del terreno privo di rosso-fenolo e si aggiunge MTT (5mg/ml) e le cellule vengono incubate a 37°C. Durante questo periodo le cellule metabolizzano MTT nel sale di formazano che, portato in soluzione con DMSO, è quantificato mediante lettura spettrofotometrica a 540 nm.

Per tale saggio le CVEC e le BBE sono state seminate alla concentrazione di 20000 cell/ml sui biomateriali in multiwell da 48 pozzetti. L’idrossiapatite è stata testata a 2, 5, 10, 100, 500 μg/ml sospendendola nel medium al 10% siero, mentre i dischetti di lega sono stati posti sul fondo del well e su di essi sono state seminate le cellule. E’ stata valutata la proliferazione a 1, 2, 4 e 7 giorni di distanza dalla semina delle cellule.

La capacità dell’HA di indurre CRESCITA CELLULARE e’ stata valutata anche come NUMERO DI CELLULE dopo 72 ore di incubazione. Le cellule (2000/100 ul/pozzetto) sono state seminate in multiwell da 96. Dopo adesione (4 ore) sono state esposte a concentrazioni crescenti di HA in presenza di 10% siero. Dopo 72 ore le cellule sono state fissate in metanolo e colorate con ematossilina-eosina. La morfologia e il numero di cellule sono state valutate al microscopio. I dati sono quindi riportati come numero di cellule contate per pozzetto.

Adesione al biomateriale

La capacità delle CVEC ad aderire e sopravvivere sui dischetti di lega di Ti13Nb13Zr nanostrutturata è stata valutata utilizzando la colorazione vitale con Acridine Orange/Ethidium Bromide, in accordo al protocollo fornitoci dalla Prof. Brandi (Università di Firenze). In tale test le cellule vitali incorporano AO mostrando al microscopio a fluorescenza, con set di filtri per FITC, una fluorescenza verde brillante mentre quelle non vitali incorporano EB mostrando una fluorescenza arancio. Per tale saggio le CVEC sono state seminate alla concentrazione di 40000 cell/ml sulla lega ed è stata valutata l’adesione a 2 giorni di distanza dalla semina delle cellule.

RISULTATI

Citotossicita’:

L’HA e’ stata testata a concentrazioni crescenti da 5 a 500 μg/ml. Si nota la formazione di cristalli che crescono di dimensione al crescere della concentrazione. I cristalli grossi (fino a appross. 100 um diametro) sembrano cluster di cristalli piu’ piccoli, di dimensioni molto inferiori alle dimensioni cellulari. A concentrazioni basse di HA (5-10 ug/ml) si notano solo i cristalli piu’ piccoli. HA non risulta essere citotossica a nessuna concentrazione.

Durante i test di citotossicità con idrossiapatite in cristalli (HA) è stato osservato che le cellule, sia le CVEC che le BBE, durante l’incubazione tendono ad aderire tra loro e ai cristalli del minerale. Tali agglomerati cellule-cristalli sono più numerosi e più grandi nei campioni contenenti le concentrazioni maggiori di HA e cioè 50 e 500 μg/ml; la dimensione dei clusters inoltre cresce con il tempo di incubazione. Per valutare se l’adesione delle cellule all’HA potesse influenzare l’incorporazione di trypan blue, le cellule sono state esposte ad HA indirettamente, utilizzando un filtro poroso tra la soluzione di HA e la sospensione cellulare. Anche in seguito a contatto non diretto, HA non risulta essere citotossica.

La citotossicita’ non cambia al variare del tipo e del numero di cellule e con il tempo di incubazione.

Anche la lega di titanio nanostruttrata non mostra attivita’ citotossica per l’endotelio in sospensione.

Migrazione:

L’osservazione della formazione degli agglomerati cellulari adesi ai cristalli di HA ha fatto ipotizzare che questo minerale avesse delle proprietà chemiotattiche per le cellule. Per verificare tale ipotesi sono stati fatti dei test di migrazione verso gradienti di HA (10-500 μg/ml) sia con le CVEC che con le BBE. HA e’ stata studiata da sola e in presenza del fattore angiogenico vascular endothelial growth factor (VEGF).

HA sembra avere una debole attivita’ chemiotattica specialmente nelle BBE e sembra interferire negativamente con la migrazione indotta dal fattore angiogenico. Al momento si stanno valutando i meccanismi alla base di tale interazione.

Proliferazione cellulare

E’ stata valutata la capacita’ dell’HA e della lega di titanio di sostenere/stimolare la proliferazione endoteliale.

Nel test utilizzato (MTT test) per la valutazione della proliferazione delle CVEC si osserva che HA in cristalli induce, alle alte dosi (100 e 500 μg/ml) un’inibizione dose e tempo dipendente della crescita cellulare, correlata alla presenza dei cristalli depositati sulla superficie dei pozzetti che alterano l’adesione e la morfologia endoteliale. Alle basse dosi  (2-10 ug/ml) HA è in grado di sostenere la proliferazione endoteliale, e sembra avere attività pro-proliferativa. Tale comportamento potrebbe essere correlabile con l’attività chemiotattica che gradienti di HA in cristalli hanno dimostrato avere nei test di migrazione.

Per le BBE i test eseguiti (MTT test e conta cellulare) hanno dimostrato che HA in cristalli non stimola la crescita endoteliale anche se è in grado di sostenerne la vitalità. Infatti, l’assorbanza delle cellule cresciute in presenza di HA in cristalli è paragonabile al controllo plastica per colture cellulari.

La lega di titanio nanostrutturata mostra la capacita’ di sostenere la sopravvivenza cellulare, sia BBE che CVEC, in quanto i dati ottenuti sono paragonabili a quelli della plastica per colture cellulari del fondo dei pozzetti (controllo plastica).

Adesione al biomateriale

Utilizzando la colorazione vitale con Acridine Orange/ Ethidium Bromide è stata valutata la capacità cellulare ad aderire e sopravvivere sui dischetti di lega di Ti13Nb13Zr nanostrutturata paragonandola alla crescita sulla plastica da colture cellulari. Dall’osservazione al microscopio a fluorescenza è emerso che vi sono aree della superficie dei dischetti in cui le cellule aderiscono e rimangono vitali, come provato dalla loro intensa fluorescenza verde, mentre in altre zone presentano fluorescenza arancio comprovante una certa sofferenza cellulare (vd allegato1).

Interazione con i biomateriali e valutazione della funzione endoteliale

Le fasi successive consisteranno nell’ analizzare al SEM e/o ESEM la morfologia cellulare sui biomateriali (in collaborazione con l’Unita’ di Napoli) e nell’analizzare l’espressione genica e proteica (di enzimi chiave del signaling intracellulare e delle funzioni endoteliali) delle cellule in seguito al loro contatto con i biomateriali.

CONCLUSIONI

I dati finora ottenuti indicano che:

1)     i biomateriali del WP2 non sono citotossici per l’endotelio

2)     HA da sola non induce proliferazione cellulare, anche se alle basse dosi la sostiene, mentre a tempi brevi (4 ore) sembra stimolare la migrazione. Ad alte concentrazioni la presenza dei cristalli ha un’influenza negativa sull’adesione e vitalita’ endoteliale

3)     La lega di Titanio nanostrutturata e’ compatibile con la vitalita’ cellulare.