VERBALE RIUNIONE 12 NOVEMBRE 2003

WP1

Il giorno 12 novembre 2003 alle ore 11,00 presso la sala del Club Eurostar di Santa Maria Novella a Firenze si sono riunite le UO facenti parte del WP1. Erano presenti i Proff. Barbucci, Marletta, Abatangelo, Favia, Barbarisi, Ziche, Giardino e Magnani, i Dott. Pascale, Rosso, Gristina, Morbidelli, Pezzatini, Lamponi, Piras e la Sig.ra Ciani.

1) Distribuzione di Campioni nanostrutturati

Il Prof. Marletta distribuisce 4 serie di campioni, come di seguito dettagliate, per ciascuna delle UO Ziche, Cortivo e Barbarisi:

n. 5 dischetti PET non trattato (0)

n. 5 dischetti PET irradiato 50 keV Ar⁺ 1x10¹⁴ cm^-2 (A)

n. 5 dischetti PET irradiato 50 keV Ar⁺ 5x10¹⁴ cm^-2 (B)

n. 5 dischetti PET irradiato 50 keV Ar⁺ 1x10¹⁴ cm^-2 (C)

avendo cura di specificare le condizioni di utilizzo degli stessi (i campioni sono fissati su nastro, la faccia irradiata e’ quella libera e il bianco è trattato con etanolo).

La Dott.ssa Morbidelli, visto il basso numero di campioni disponibili, propone di fissare al massimo due tempi caratteristici di incubazione. Il Prof. Marletta osserva che la scelta dei tempi dipende dalla vitalità delle cellule e propone quindi di definire i tempi di test per ogni tipo cellulare e si concorda di utilizzare tempi differenziati per le diverse linee cellulari.

2) Stato di avanzamento delle attività

2’) Il Prof. Marletta procede ad illustrare gli aggiornamenti ottenuti negli ultimi 2 mesi in termini di analisi XPS e di caratterizzazione dell’energia libera di superfici per lo HYAFF e per altri campioni irradiati distribuiti alle UO biologiche (v.allegato 1). A conclusione dell’esposizione si concorda di effettuare i test di adesione cellulare sui campioni di HYAFF modificati mediante fasci ionici, al fine di verificare la risposta cellulare alle modifiche indotte per irradiazione.

2’’) Il Dott. Rosso espone quindi i risultati degli esperimenti di coltura cellulare di fibroblasti sulle superfici di campioni di PET tessuto e film modello, di PTFE tessuto e relativo film modello di PET ricoperto con Carbonio pirolitico (tessuto), indicato di seguito come PET/C (v. allegato 2).

Il Prof. Barbucci chiede se il PET è quello della Sorin.

Il Dott. Rosso risponde che il tessuto proviene in effetti dalla SORIN, mentre il film modello è stato comprato dalla Goodfellow, in accordo con quanto deciso a suo tempo.

Il Dott. Rosso espone la procedura di coltura cellulare, da cui risulta che una serie di test sono stati fatti utilizzando colla di fibrina per fissare i campioni di tessuto al fondo delle capsule di Petri, mentre altri test sono stati effettuati senza usare la colla di fibrina. Si apre il dibattito sulla procedura in questione e si concorda infine che a) il confronto fra campioni testati utilizzando la colla di fibrina e campioni per cui tale colla non è stata utilizzata mostra che in effetti essa sembra avere un ovvio effetto di stimolo alla crescita cellulare. A conclusione di un ampio dibattito si concorda che le prove verranno ripetute senza colla di fibrina.

In particolare si concorda di utilizzare pozzetti di dimensioni ridotte (multi-well da 48 pozzetti di 1 cm di diametro) in modo da fissare “meccanicamente” i campioni. Il Prof. Giardino (subcontratto) suggerisce specificamente di utilizzare multiwell da 1,3 cm di diametro.

Vengono fatte osservazioni sulle procedure di conteggio delle cellule e sulle relative calibrazioni sia da parte del prof. Marletta che da parte del prof. Barbucci. Il dott. Rosso ne prende atto.

Il Prof. Barbucci sottolinea l’importanza di effettuare i test biologici in maniera esaustiva e riproducibile, in modo da avere punti di riferimento ben definiti rispetto ai test su campioni nanostrutturati.

Il Prof. Abatangelo osserva a questo punto che i dati esposti dal Dott. Rosso riproducono per i fibroblasti il trend dei risultati ottenuti dall’UO Cortivo con cellule mesenchimali (v. verbale della riunione di Grosseto), con una buona compatibilità del PET, comparabile con quella del riferimento scelto (polistirene per colture cellulari), ed una scarsa citocompatibilità di PET ricoperto da carbonio pirolitico e PTFE.

2’’’) Si passa all’esposizione dei risultati dell’UO Ziche, che viene effettuata dalla Dott.ssa Morbidelli (allegato 3). Cellule endoteliali sono state fatte crescere a tempi di incubazione diversi da 24 ore sino ad una settimana. In particolare viene riportato un confronto fra i dati ottenuti fissando i campioni con silicone e con colla di fibrina. Si osserva che tutti i campioni mostrano una debole citocompatibilità quando fissati con silicone, mentre la presenza di colla di fibrina svela una aumentata biocompatibilità su PET film. PTFE e Hyaff risultano di scarsissima citocompatibilità in ambedue i casi. Considerando i tessuti fissati con silicone, solo il PTFE-C presenta una maggiore biocompatibilità. In tutte le condizioni sperimentali tutti i biomateriali danno una biocompatibilità nettamente inferiore al controllo di plastica (polistirene) per colture cellulari. Lo studio della morfologia cellulare (basata sull’uso di coloranti fluorescenti a 2 giorni di incubazione) conferma una situazione di sofferenza cellulare su PTFE film, ma non su PET film.

Il Prof. Giardino osserva che i dati mostrano comunque differenze nei risultati tra cellule endoteliali e fibroblasti (UO Barbarisi), che possono costituire la base per una serie di indagini ulteriori. Il Prof. Marletta osserva a sua volta che il principale risultato dell’attività dell’UO Ziche va visto nella conferma sperimentale dell’effetto della colla di fibrina nello stimolare selettivamente l’adesione cellulare su certe superfici (in questo caso quella di PET film) e suggerisce che le differenze possono essere originate da differenze nella capacità di interazione della colla di fibrina su superfici di caratteristiche diverse quali quelle di PET, PET/C e di PTFE. La Prof. Ziche concorda con la conclusione. Il Prof. Marletta osserva inoltre la UO Ziche dovrà ripetere gli esperimenti di riferimento senza utilizzare colla di fibrina, in modo da poter effettuare nello stesso modo anche i test di citocompatibilità sui campioni forniti dall’UO Marletta. L’obiettivo globale è di mettere a punto una metodologia che non abbia effetti secondari sui test biologici stessi.

Il Prof. Barbucci sottolinea la necessità che i biologi stabiliscano una metodologia comune definitiva, che permetta di ottenere risultati fra loro pienamente confrontabili. Suggerisce la necessità di riunioni ad hoc fra le tre UO biologiche, al di là delle riunioni di analisi dei risultati più generali del progetto.

2’^v) Si procede quindi all’esposizione dei risultati dell’UO Cortivo da parte del prof. Abatangelo (allegato 4) sui risultati ottenuti con condrociti e cellule mesenchimali. I test mostrano che la citocompatibilità dei condrociti sul PET (film) è significativamente migliore di quella osservata per il PTFE e HYAFF.

2^v) Si procede quindi con l’esposizione dei risultati dell’UO Favia (allegato 5). Il prof. Favia porta all’attenzione delle altre UO un possibile effetto del processo di sterilizzazione mediante etilenossido (EtO) sulla morfologia dei campioni depositati in plasma. La tipica morfologia, consistente di strutture filiformi sulle superfici, viene infatti “smoothed” dal trattamento con EtO e mostra delle macchie caratteristiche e una diversa morfologia. In particolare, il Prof. Favia suggerisce che la superficie dei campioni sterilizzati con EtO sia contaminata, come dimostra l’angolo diverso, ma comunque elevato. La contaminazione comunque viene eliminata mediante un trattamento di 1-2 gg in UHV, con rimozione delle macchie. Nel dibattito che ne segue, risulta che la struttura chimica delle superfici controllata mediante misure XPS prima e dopo trattamento con EtO rimane tuttavia sostanzialmente immutata.

Il Prof. Favia afferma infine che mentre le strutture depositate in plasma sono evidentemente sensibili al trattamento con EtO, un semplice processo di sterilizzazione mediante etanolo non modifica sostanzialmente la superficie, né composizionalmente né morfologicamente.

Le osservazioni del prof.Favia aprono un largo dibattito sulle procedure di sterilizzazione con EtO, che richiedono tempi variabili di degassaggio, in dipendenza del tipo di materiale sterilizzato. A conclusione del dibattito viene concordata una procedura standard di sterilizzazione alternativa basata sull’uso di etanolo.

Al fine di poter disporre dei primi risultati su superfici trattate il Prof. Marletta, seguendo un suggerimento del prof. Barbucci,  propone che ogni UO abbia i campioni delle superfici depositate a Bari, in modo da avere per il 7 dicembre un rapporto preliminare sui risultati di adesione cellulare sulle superfici in questione e da permetterne il confronto con i risultati ottenuti sulle superfici non trattate.

2^v’) Si passa all’esposizione dei risultati conseguiti dall’UO CRISMA (prof. Barbucci). I risultati vengono esposti dalla Dr.ssa Piras (allegato 6), che discute in dettaglio i problemi connessi alla microstrutturazione delle superfici mediante grafting fotochimica. Si apre un ampio dibattito sui dati, a conclusione del quale si procede a delineare le attività per la conclusione delle attività del primo anno di attività.

3) Problemi specifici relativi ai materiali

Si passa quindi all’illustrazione dei risultati ottenuti e riconfermati in esperimenti recenti sulle fibre di PET fornite da Sorin (allegato 7). La Dott.ssa Pascale specifica che in effetti le fibre vengono acquisite commercialmente da Sorin, che si limita a ricoprire di carbonio pirolitico il tessuto.

Si conviene di testare le proprietà di film modello di carbonio pirolitico prodotto da Sorin, per avere un riferimento certo delle proprietà di adesione cellulare delle fibre ricoperte, in analogia ai film modello che costituiscono il riferimento per i campioni di PET e PTFE tessuti.

Il Prof. Barbucci suggerisce che la Sorin fornisca dei campioni di film di PET (Goodfellow) ricoperti di carbonio pirolitico, in modo da ottenere i desiderati campioni bidimensionali per test biologici di riferimento.

Con riferimento ai film depositati a Bari, il prof. Favia chiede se il coating di carbonio pirolitico possa essere depositato in modo da ricoprire in modo conforme le nanostrutture di materiale teflon-like depositato.

La Dott.ssa Pascale risponde che lo spessore di carbonio pirolitico deponibile con processo industriale va da 0,3 a 0,5 micron, in quanto spessori minori non garantiscono l’omogeneità dello spessore. Si decide di rinviare il problema di un eventuale coating delle superfici deposte in plasma all’identificazione di un opportuno processo di deposizione di carbonio pirolitico conforme con spessore dell’ordine nanometrico.

Il Prof. Abatangelo riferisce di essersi attivato per ottenere uno scaffold biologico a base di collagene. In queste fibre entrano i cristalli di idrossiapatite e quindi ci possono entrare anche le cellule. Si accetta la proposta di tale materiale nuovo, con l’intesa che esperimenti verranno concordati nel primo semestre del secondo anno di attività.

4) Programmazione delle attività

Il Prof. Barbucci ricapitola una serie di attività da sviluppare nel futuro immediato: a) vedere quali materiali prendere in considerazione; b) lo Hyaff viene momentaneamente abbandonato, ma sarà riconsiderato in seguito; c) fare il punto della situazione sulle linee cellulari decidendo i materiali migliori e peggiori.

Sulla base delle considerazioni del Prof. Giardino, viene inoltre puntualizzata la necessità di caratterizzare metabolismo ed espressione cellulare sui campioni di riferimento, per permettere un confronto efficace con le caratteristiche delle varie linee cellulari sui materiali nanostrutturati.

Il Prof. Marletta propone inoltre di programmare una serie di esperimenti di test biologici di riferimento che permettano di definire in modo definitivo  procedure di test standard.

A questo fine il Prof. Marletta stabilisce che entro il 7 dicembre le UO biologiche dovranno far pervenire i risultati degli esperimenti in questione, unitamente alle caratterizzazioni di campioni nanostrutturati.

Si concorda in particolare di effettuare le prove usuali di adesione cellulare e si distribuiscono i compiti specifici per le UO biologiche.

Il prof. Marletta propone di definire i compiti delle diverse UO in riferimento ai diversi tipi cellulari a suo tempo prescelti. In particolare, l’UO Ziche si dovrà occupare inoltre, in accordo con il progetto a suo tempo approvato dal MIUR, della parte relativa alla biologia molecolare: a) caratterizzazione del processo di interazione dal punto di vista della biologia cellulare; b) caratterizzazione delle proteine espresse nel processo di interazione delle cellule con i vari substrati modificati e non.

La Prof. Ziche porta all’attenzione delle altre UO la necessità di utilizzare microscopi a scansione per l’analisi dettagliata della morfologia cellulare e delle eventuali sue modifiche a seguito dell’interazione con le superfici nanostrutturate. Bisogna quindi prevedere l’inserimento di una competenza specifica per tale compito. Il prof.Marletta propone di effettuare una opportuna ricognizione per verificare la disponibilità di tali competenze e risorse sia nell’ambito delle UO del Progetto che al di fuori, in modo da poter proporre una soluzione operativa nel corso della prima metà del secondo anno di attività.

In ogni caso, per chiudere opportunamente le attività del primo anno, si propone che entro il 7 dicembre le UO biologiche a) valutino il comportamento adesivo delle varie linee cellulari prescelte senza colla di fibrina e b) oltre ai test di proliferazione, si effettuino tentativi preliminari di valutazione della morfologia delle cellule adese.

A conclusione della discussione il Prof. Marletta espone un semplice schema di attività per il secondo anno di attività:

1)  nuovi trattamenti di nanostrutturazione delle superfici effettuati dalle UO Catania, Bari e Siena (CRISMA);

2) Test biologici: - caratterizzazione del     metabolismo cellulare su superfici modificate

   - caratterizzazione della morfologia cellulare

3)  Materiali:- focalizzare le attività sul PET quale substrato modello;

    - per il carbonio pirolitico: test biologici su film modello e modifica di superfici di carbonio pirolitico (supportate su PET)

I film di PET ricoperto di carbonio pirolitico saranno forniti da Sorin.

In particolare, il prof. Marletta propone di procedere con slot sperimentali trimestrali e con verifica trimestrale mediante riunioni ad hoc.

Nel primo trimestre verrà testato il PET ricoperto di carbonio pirolitico sui cui fare i consueti test con le tre linee cellulari prescelte, in modo da procedere sinergicamente e valutando tutti gli aspetti per ciascun materiale.

Il Prof. Favia effettuerà inoltre esperimenti coinvolgenti un secondo coating per modificare la chimica dei film teflon-like ottenuti mediante coating di film PEO-like e mantenere la morfologia-nanostrutturata già ottenuta dall’UO di Bari.

Infine alla fine II anno dovrà essere concluso il primo giro di materiali completamente ed esaurientemente sottoposti ai test biologici.

5) Conclusioni e raccomandazioni alle UO

Il Prof. Barbucci ricorda alla fine del primo anno può essere fatta una rimodulazione scientifica nonché economica, con regole e limiti precisi ed invita le diverse UO a predisporre eventuali rimodulazioni.

La riunione è chiusa alle ore 16,00