S. Oliviero

Programma BIOLOGIA MOLECOLARE

AA 2007/2008 Biotecnologie

STRUTTURA E TOPOLOGIA DI DNA e RNA. Nucleotidi. Superavvolgimento. Strutture secondarie. Denaturazione e rinaturazione. Enzimi che agiscono sul DNA. Genoma umano.

LE TECNOLOGIE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE. Vettori plasmidici. Enzimi di restrizione e di modificazione del DNA. Mappa di restrizione. Clonazione e manipoloazione di geni clonati. P.C.R. principi ed applicazioni. Sequenza del DNA. Sequenza del genoma umano.

Analisi dell'espressione genica: microarray, RT-PCR. Animali transgenici.

CONTROLLO TRASCRIZIONALE IN IN PROCARIOTI. Promotori di procarioti. L'RNA polimerasi batterica, il ruolo dei fattori sigma nella sporulazione e shock termico. La terminazione della trascrizione. Operone del lattosio: interazione con il repressore, mutanti costitutivi, reppresione da cataboliti. L'attenuazione.

CICLO LITICO E LISOGENICO DEL FAGO LAMBDA. Ciclo litico e lisogenico, Immunita'. Struttura e funzione cI, cro, pN, cII, cIII. Regolazione dei promotori PRE e PRM. I controllo negativo, il controllo positivo, l'antiterminazione. Integrazione ed escissione dal DNA batterico.

IMPACCAMENTO DEL DNA. Le proteine della cromatina. Il nucleosoma, sensibilità alla nuclesi micrococcica, ipersensibilità alla DNAasi I. La metilazione del DNA, isole GpC.

CONTROLLO TRASCRIZIONALE IN EUCARIOTI. L'RNA polimerasi. I fattori generali della trascrizione. Assemblaggio del complesso trascrizionale. Promotori eucariotici ed enhancer. I fattori gene specifici. Caratteristiche dei domini di interazione con il DNA e di attivazione trascrizionale. Modelli di attivazione trascrizionale. La variabilità di regolazione dei promotori di eucarioti. Struttura della cromatina ed espressione genica. Modificazioni epigenetiche.

MATURAZIONE DEGLI RNA IN EUCARIOTI. hnRNA, capping, Poliadenilazione. Processamento di tRNA, rRNA ed mRNA. Ruolo dei piccoli RNA nello spicing. Formazione dello spliceosoma. Autosplicing. Splicing alternativi. Proprietà catalitiche dell'RNA. Trasporto di RNA nucleo-citoplasma.

LA TRADUZIONE IN PROCARIOTI ED EUCARIOTI. tRNA, le sintetasi ed il codice genetico, tRNA sopppressori. L'assemblaggio del complesso traduzionale sull'RNA. La regolazione traduzionale della sintesi proteica. RNA interference e microRNA, RISC

LA REPLICAZIONE DEL DNA IN BATTERI, EUCARIOTI E RETROVIRUS. Origine di replicazione di E. coli. e di plasmidi. Origini di replicazuione di eucarioti. DNA polimerasi. Sintesi delle emieliche guida e tardiva. Replicazione di Retrovirus, eventi di trasduzione nel genoma virale.

Programma MODULO METODI DI BIOLOGIA MOLECOLARE

Prof. Marina Rocchigiani

PREPARAZIONE DI TAMPONI
Uso della bilancia analitica e misurazione del pH.

MINIPREPARAZIONI DI DNA PLASMIDICO
Estrazione di DNA plasmidico da colture batteriche per lisi alcalina, preparazione di gel d'agarosio e corsa elettroforetica del plasmide purificato

ENZIMI DI RESTRIZIONE
Digestione enzimatica del plasmide purificato, migrazione elettroforetica ed analisi del DNA digerito.

OLIGONUCLEOTIDI e PCR
Disegnare oligonucleotidi Fw e Rev su sequenze di dsDNA per effettuare una reazione di PCR, analisi mediante elettroforesi del DNA amplificato

USO DI VETTORI PLASMIDICI E CLONAGGIO di cDNA
Programmazione di un clonaggio di proteine di fusione all'N- e al C-terminale. Scelta degli enzimi di digestione, disegno di oligonucleotidi per mantenere il “frame” tra le due proteine.