L'organizzazione del genoma cellulare: struttura primaria del DNA, strutture di tipo secondario. Denaturazione e rinaturazione. Organizzazione del DNA in cromosomi: il cromosoma di E.coli e delle cellule eucariotiche. La replicazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti: i repliconi, origine e termine della replicazione, ColE1, i plasmidi batterici, la coniugazione batterica, il controllo del numero di copie nei plasmidi. Restrizione e riparo del DNA. Regolazione dell'espressione genica nei procarioti: promotori della trascrizione, attivatori e repressori. Gli operoni: operone lac: struttura, induzione e repressione, repressione catabolica; operone ara: struttura, meccanismo di regolazione; operone trp: il meccanismo dell'attenuazione della trascrizione. La risposta SOS di E.coli.

Caratteristiche generali, metodi di crescita, manipolazione e conservazione di batteri e lieviti. Preparazione di cellule competenti di batterio e di lievito. Trasformazione di cellule batteriche e di lievito con DNA plasmidico.

Metodi di estrazione e purificazione del DNA plasmidico.

Analisi del DNA tramite elettroforesi su gel di agarosio e su gel di poliacrilammide. Elettroforesi pulsata del DNA genomico. Southern blotting, dot e slot blotting del DNA.

Estrazione ed analisi di RNA da cellule procariote ed eucariote. Northern blotting.

Metodi di sequenziamento del DNA: metodo di Maxam e Gilbert e metodo di Sanger; rivelazione del DNA sequenziato con metodi radioattivi e non. Sequenziamento automatico del DNA.

La tecnologia del DNA ricombinante: i vettori di clonaggio: vettori derivanti da plasmidi, vettori derivanti da batteriofago l; vettori cosmidici, vettori derivanti da fagi filamentosi.

Enzimi impiegati per il clonaggio o la manipolazione del DNA: endonucleasi di restrizione, metilasi, ligasi, polimerasi, chinasi , nucleasi.

Clonaggio del DNA ricombinante: strategie, selezione e analisi dei ricombinanti.

La tecnica P.C.R.: principi generali, parametri critici, applicazioni. RT-PCR, PCR in situ, “cycle sequencing”. Uso della P.C.R. nella mutagenesi in vitro.

Benjamin Lewin, "Il Gene VI", Zanichelli.

Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, “Biotecnologia Molecolare”, Zanichelli

Harvey Lodish et al., “Biologia Molecolare della Cellula”, Zanichelli

Sambrook, Fritsch, Maniatis, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory press.

Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.

Il flusso dell'informazione genetica; L'organizzazione dei genomi cellulari; La complessità dei genomi eucarioti. La mappatura ed il sequenziamento completo dei genomi: il Progetto Genoma; Sintesi proteica, processamento e regolazione; La mappatura del repertorio proteico cellulare: il Progetto Proteoma; Saccharomyces cerevisiae come cellula modello degli organismi eucarioti; Saccharomyces cerevisiae come strumento in applicazioni biotecnologiche; : Testi consigliati: Il Docente provvederà a fornire il materiale didattico; di riferimento.

Testi di consultazione: Biotecnologia Molecolare - B.R. Glick, J.J.

Pasternak - Zanichelli; The Cell, A molecular approach- G.M. Cooper- Oxford University Press

Utilizzazione dei microrganismi nei processi industriali. Classificazione dei microrganismi. Metodi di screening, isolamento e conservazione di microrganismi di interesse industriale.

Crescita dei microrganismi: trofofase e idiofase e produzione dei metaboliti primari e secondari. Fattori ambientali che condizionano la crescita. Colture in batch e in continuo. Fermentazione su larga scala. Influenza delle condizioni di crescita sui livelli di produzione. Proteine microbiche: produzione e utilizzazione. Produzione di metaboliti primari (alcool, aminoacidi, enzimi, acidi organici). Produzione di metaboliti secondari (antibiotici). Meccanismo d’azione degli antibiotici. Resistenza agli antibiotici. Strategie utilizzate per aumentare le rese: mutanti auxotrofi, mutanti insensibili a feedback, mutanti deregolati. Produzione di proteine eterologhe. Esempi di produzione di farmaci da microrganismi ingegnerizzati (interferone, insulina, somatostatina, ormone della crescita ). Vaccini, problemi con i vaccini tradizionali, vaccini sintetici, vaccini antiidiotipici, vaccini ricombinanti.

Il principale obiettivo del corso integrato di Fisiologia Cellulare è quello di fornire allo studente una conoscenza approfondita dei principi che sono alla base delle funzioni cellulari per una migliore comprensione delle nuove strategie adottate nell’ambito delle biotecnologie farmaceutiche. In particolare:

Le giunzioni intercellulari; proteine di adesione e loro controllo

Canali ionici: interazione con tossine e farmaci e loro regolazione

Messaggeri extracellulari e recettori chimici

I messaggeri locali; meccanismi paracrini e autocrini

Fattori di crescita, di differenziazione e di trasformazione

Cross-talk recettoriale

Controllo extracellulare della trascrizione

Il controllo della crescita cellulare

Controllo della funzione endocrina

Relazioni e integrazioni tra i sistemi endocrino, nervoso e immunitario

Interleuchine e linfochine: classificazione, modalità di azione

Regolazione del ciclo cellulare

Cicline e chinasi-ciclina dipendenti; checkpoints molecolari

Oncogeni, antioncogeni e controllo della trascrizione

Proliferazione cellulare ed apoptosi

RIFERIMENTO PRINCIPALE E TESTI CONSIGLIATI: Appunti delle lezioni. G. Rindi, E. Manni, Fisiologia umana, UTET. Rhoades & Pflanzer, Fisiologia Umana, Piccin

TESTI DI CONSULTAZIONE: Sperelakis: Cell Physiology, A Molecular Approach. Academic Press. Alberts-Bray-Johnson-Lewis-Raff-Roberts-Watson: Molecular Biology of The Cell. Garland Publishing

Il corso verterà sugli aspetti più innovativi delle tecnologie biochimiche post-genomiche. La Biochimica e le sue tecnologie dopo la decifrazione del genoma umano. Transcriptomica: Gene microarray; Proteomica: Elettroforesi bidimensionale computerizzata; Sequenziamento di proteine; Spettrometria di Massa; Bioinformatica; Tecnologia del doppio; ibrido; Elettroforesi bidimensionale, bioinformatica e tecnologia del doppio ibrido saranno anche oggetto di esperienze in lalaboratorio.

Testi consigliati: Il Docente provvederà a fornire il materiale didattico; di riferimento.

Testi di consultazione: Metodologie di base per la biochimica e la; biotecnologia - A.J.Ninfa, D.P. Ballou- Zanichelli.